实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）

1简介

1992年，日本人Higuchi最早提出了“实时荧光定量PCR技术”（Real-time PCR）。1996年，美国生物公司推出全球首台荧光定量PCR仪，由PCR扩增热循环系统、荧光检测光学系统、计算机及应用软件组成。通过荧光染料或荧光探针，对核酸扩增产物进行实时监测；通过数学函数关系，结合软件进行结果分析，实现计算待测样品的初始模板量的计算。由此，实时荧光定量PCR技术得到广泛的应用。

Real-time PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-time PCR通过在PCR扩增体系中掺入荧光染料，检测扩增过程中的产生荧光信号，可以对PCR的扩增进程进行实时检测。且由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

Real-time PCR主要由定量PCR仪，八联管，试剂及PC分析端等几部分组成。

2原理

Real-time PCR的原理依据测试方法不同存在区别。Real-time PCR主要包括荧光标记法及荧光探针法。荧光标记法指以SYBR Green I染料法为主的荧光染料嵌合法；荧光探针法指以Taqman探针法为主的淬灭染料引物法。

2.1 SYBR Green I染料法原理

SYBR Green I是一种高灵敏度的非特异性双链DNA荧光染料，具有绿色激发波长。DNA发生扩增时，SYBR Green I可以非特异性的结合在dsDNA双螺旋小沟区域。

游离的SYBR Green I只发出极弱的荧光信号，而嵌合在扩增产物（dsDNA）双螺旋小沟区域中的SYBR Green I会发出强荧光，荧光信号被千倍放大，且在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。因此，可以通过检测荧光信号的强度从而检测初始dsDNA的浓度。

SYBR Green I染料法操作简单、灵敏度高、成本较低，被广泛地应用于DNA及RNA定量、基因表达量的研究、转基因重组动植物的研究等，但是因为SYBR Green I与dsDNA双螺旋的结合是非特异性的。所以SYBR Green I与特异性扩增产物（目标dsDNA）结合的同时还可以同引物二聚体及非特异性扩增的dsDNA结合，可能影响结果判断。所以扩增反应结束后，还必须对生成的dsDNA进行分析：即通过升温使dsDNA双链解开，SYBR Green I染料脱落，荧光值逐渐下降，形成温度和荧光强度的曲线：即“熔解曲线（Melting curve）”。依据溶解曲线是否为单峰来判断扩增体系中是否存在引物二聚体或者非特异性扩增（注：因为不同的扩增产物的Tm值存在差异，所以如果产物中存在非特异性扩增，则会出现多峰现象）。

2.1 Taqman探针法

Taqman探针是由5’端标记有荧光报告基团和3’端标记有淬灭基团以及与目标基因特异性结合的寡核苷酸序列组成。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，此时仪器不会检测到荧光信号。在PCR扩增时，模板DNA变性解链，Taqman探针特异性结合到目标基因处，而Taq酶具有5’-3’核酸外切酶活性，延伸至探针结合处，可将探针水解，使荧光报告基团和淬灭基团分离，从而检测到荧光信号，荧光信号的强度与扩增得到的dsDNA的浓度成正比。荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线”，通过荧光信号的强度反映出体系中dsDNA的浓度。

笔者一般使用的是SYBR Green I染料法，对Taqman探针不是特别了解。总结Taqman探针法的原理为：Taqman探针法的扩增试剂中包含有5’端标记有荧光报告基团和3’端标记有淬灭基团的寡核苷酸探针（与单链DNA结合）以及能与目标基因特异性结合的含Taq酶（具备5’-3’外切酶活性）的寡核苷酸序列。只有发生特异性扩增时，Taq酶才会剪切寡核苷酸探针，将荧光报告基团剪切脱落。从而激发荧光。

参考文章链接：

1.https://zhuanlan.zhihu.com/p/565126750

2.https://baike.baidu.com/item/%E5%AE%9E%E6%97%B6%E8%8D%A7%E5%85%89%E5%AE%9A%E9%87%8FPCR/5395897

3 Real-time PCR机型

为什么要介绍Real-time PCR的机型呢？因为Real-time PCR的上机不同于WB的曝光（WB的曝光可能因为机型的原因，在程序操作上存在区别，但是只要你有条带和显影液，基本上都是能曝光出来的）。

但是Real-time PCR的上机却因为机型的不同存在很大的区别（不要问我为什么知道，当你骑个电动车，拿着配好的模板，逛了三四个实验室发现都无法上机时，你就这辈子都不会忘记Real-time PCR上机存在机型不同了（手动苦涩））。

首先，不同的机型使用的八联管不一样，就笔者所了解的八联管就分为高管、低管及96孔的套管等等。强行使用与机型不匹配的八联管上机不仅无法得到正确的实验结果，而且会损坏仪器（注意：很大概率损坏，因为PCR扩增温度的控制是通过仪器与八联管接触的热盖来进行控制的。如果使用与机型不匹配的八联管进行上机时；eg：高管仪器上低管八联管，仪器热盖与八联管不接触，无法进行PCR扩增；低管仪器上高管八联管，挤压PCR仪热盖，造成仪器损坏）。

其次，Real-time PCR的试剂中有一个叫Rox的试剂，它是仪器的矫正染料，可以矫正孔板及试剂蒸发产生的误差等（这里必须注意的是：不同机型的Rox的种类不同，就我所知的诺唯赞和Takela的试剂中就分Rox I和Rox II）。

仪器介绍链接：https://www.docin.com/p-2348809832.html

4实验步骤

Real-time PCR的实验步骤并不是非常复杂，主要包括RNA提取—反转录—体系配制—上机及结果分析等几个步骤（以后有机会的话再跟大家介绍）。

5引物设计

最后，给大家介绍一下Real-time PCR的引物介绍：

5.1搜索NCBI

5.2选择Gene，输入需要合成引物的名字及种属

5.3选择对应种属的基因选项

5.4进入后下翻至accession number号

5.5进入后选择Pick Primers

5.6进入后选择扩增产物的大小，及是否跨外显子

5.7点击Get primers后，可以得到相应的引物

选择引物时：遵循下述原则（见链接）

https://www.biomart.cn/specials/4abio/article/528822

本文作者：LGN

审核：猪猪

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