浅谈基因改造中快速PCR定点突变方法及研究

1 材料

11 菌株与质粒 E.coli DH5α，由本实验室保存。质粒pESOD(含hCu，Zn-SOD基因、Ampr基因以及EcoRI酶切位点，整个质粒约33kb)由本实验室构建，并转化于E.coli DH5α保存。

12 主要试剂 Pfu高保真DNA聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)；DpnI酶(河南华美生物工程有限公司);小量质粒快速抽提纯化试剂盒(上海博亚生物技术有限公司);DNA Marker,T4DNA连接酶，Eco RI等常规酶(上海Sangon公司)。

13 pESOD质粒提取及鉴定 用质粒快速抽提纯化试剂盒从含pESOD质粒的E.coli DH5α转化菌里提取pESOD质粒，取部分质粒用EcoRI酶切后琼脂糖电泳鉴定，另取部分质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。

14 定点突变

143 转化 用Dpn I限制性内切酶处理PCR反应产物，直接转化感受态的E.coli DH5α，涂布培养后随机挑3个菌落并提取相应质粒，由上海博亚生物技术育限公司测序，测序引物P3：5′ACTCAGGTACTGGGAGTG 3′。

2 结果

21 提取的质粒经EcoRI酶切后琼脂糖电泳 质粒大小为3300bp左右，证明所提取的质粒就是pESOD质粒，见图1。

图1 pESOD质粒经EeoRI酶切后琼脂糖电泳（略）

22 PESOD质粒测序的部分结果   所测序列与文献