拟Smac作用下膀胱癌T24 细胞增殖及凋亡的研究

引言

Smac/DIABLO 蛋白（线粒体促凋亡蛋白）自被发现以来，经过几年的研究已经成为细胞凋亡研究中的一个热点。近年来，国内外很多学者将其应用于泌尿系统肿瘤研究和治疗，并认为Smac/DIABLO及由它衍生而来的小分子多肽及其类似物将为未来泌尿系统肿瘤的治疗开辟一个新领域[1]。纳米技术作为近年来出现的高技术新兴科学，由于其表现出现的各种特性，有利于医学及其各个分支的研究，特别是对肿瘤的早期诊断和治疗有着显着的意义。 其他常用生化试剂购自美国Sigma 公司。

2.2 细胞培养与实验分组实验

2.3 MTT 检测细胞增殖参照 MTT 试剂盒使用说明。

2.4 Hoechst33258 检测细胞凋亡将各实验组

2.5 实时荧光定量PCR（Realtime RT-PCR）检测

2.6 蛋白免疫印迹（Western-Blot）检测

2.7 统计学分析所有数据

均以x ± s表示，采用SPSS15.0统计软件处理，不同处理组间差异采用ANOVA或 Dunnett T-test，P<0.05 为差异有统计学意义。

3. 结果3.1 SmacN7-O-CMC-MNPS 联合磁场

能显着抑制膀胱癌T24 细胞增殖及诱导凋亡和对照组相比，SmacN7-O-CMC-MNPS转染膀胱癌T24 细胞后和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁场组均不同程度地出现肿瘤细胞生长抑制和凋亡；而SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒外加磁场对T24 细胞的生长抑制作用和诱导凋亡作用更明显。

3.2 SmacN7-O-CMC-MNPS

联合磁场对膀胱癌T24 细胞凋亡相关基因的mRNA及蛋白表达的影响在外磁场条件下，SmacN7-O-CMC-MNPS 转染膀胱癌T24 细胞24h、48h、72h 后采用Realtime RT-PCR 及Western blot 检测，结果可见Bcl-2 的mRNA 和蛋白的表达随着作用时间的延长而逐渐降低。相反，Bax 的表达量则逐渐升高，且此效应比不加磁场的SmacN7-O-CMC-MNPS 转染膀胱癌T24 细胞的作用更明显，这说明外磁场条件下SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒能透过膀胱癌T24 细胞细胞膜，通过干扰凋亡信号传导通路诱导细胞的凋亡。

4. 讨论Smac/DIABLO 在胞浆中合成最初的前体蛋白

含239 个氨基酸，分子量为27KD，SmacmRNA 全长1.5Kb。全长的Smac/DIABLO 蛋白没有任何活性，必须在线粒体内进行信号肽的切除后才能获得促凋亡生物活性。Smac/DIABLO 参与细胞凋亡的死亡受体通路和线粒体通路的下游反应，通过竞争性地结合凋亡抑制蛋白IAPs 解除对caspase 的阻遏而促进凋亡的发生。Smac/DIABLO 蛋白衍生的含AVPI 四肽结构的小分子多肽也具有重要的抗肿瘤效果。研究表明，Smac/DIABLO 小肽与载体蛋白结合并转染细胞后可以使体内和体外化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡效果明显增加。Smac/DIABLO 蛋白通过干扰凋亡信号转导通路，促进肿瘤细胞凋亡，抑制其过度增殖。

多肽合成技术的突破性进步，使多肽类药物显示出优于传统药物的治疗效果，但由于其具有难以透过生物膜屏障且不稳定、易降解变性等特点限制了它的临床应用。如果将靶向药物进行适当修饰就可能起到保护药物，提高药物的稳定性，促进药物的吸收利用，进而产生良好的生物学效果。磁性纳米颗粒可以作为多肽、激素、单克隆抗体、基因等物质的载体，也可以携带药物；同时它具有超顺磁特性，即在磁场中有较强的磁性，没有磁场时磁性很快会消失，从而不会被永久磁化；而且纳米级Fe3O4 能够排出体外，在外加磁场的作用下可以使得其作为载体复合物所携带的药物作定向移动，从而实现靶向治疗。

Smac 是一种新型的线粒体促凋亡蛋白，其N 端的AVPI 四肽发挥着重要的促凋亡作用。本实验通过合成拟Smac 多肽羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物，在外加磁场下作用于膀胱癌T24 细胞，实验数据显示，外加磁场的诱导下SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒能发挥拟Smac 合成肽的抑制肿瘤细胞增殖及促凋亡作用，且外加磁场作用更为明显。而且，SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒是通过调控凋亡相关基因Bcl-2，Bax 来影响肿瘤细胞的活性。

综上，本实验首次将人工合成促凋亡多肽制成磁性纳米颗粒SmacN7-O-CMC-MNPS 在外加磁场下作用于膀胱癌细胞，显着抑制了肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡，为膀胱肿瘤的体内磁导向靶向治疗提供了有力的实验保障。