前言

STAT蛋白是哺乳动物中一组经过进化保守的转录因子家族，蛋白是受体和非受体酪氨酸激酶的底物，如Janus激酶。它们在细胞表面受体结合配体后催化它们的C末端酪氨酸残基的磷酸化。

已知50种不同的生长因子和细胞因子，包括干扰素、白细胞介素和生长激素，可以通过STAT蛋白信号传导。激活的STAT蛋白在细胞核内积累，参与数百个基因的转录。

通过互相磷酸酪氨酸SH2结构域相互作用使STAT蛋白二聚化。二聚体可以结合靶基因启动子区域的短回文DNA序列称为GAS元件。除了同源二聚体外，激活的STAT蛋白还与其他家族成员组装成异源二聚体。

一 潜在STAT蛋白质的自组装

STAT蛋白的磷酸酪氨酸介导的功能与它们的二聚化联系在一起，未磷酸化的蛋白的构成性自组装仍知之甚少。STATs是单体，可以在酪氨酸磷酸化之前就组装成高分子量复合物。一个有力的例子是STAT1，在分析超离心仪中显示，在激活前后形成同样强度的二聚体。

未磷酸化的STAT1、STAT3和STAT5二聚体的稳定性不是由羧基末端SH2结构域的相互作用所产生的，而是由氨基端区域之间的相互作用所产生的。导致单体的反向排列，磷酸化二聚体中的平行排列不同。

未磷酸化的蛋白参与了正常和病理情况下许多生物事件。在某些情况下，STATs的自组装已经与酪氨酸磷酸化和细胞因子信号传导联系在一起。

STAT4的同源二聚化是细胞因子诱导的STAT4激活的先决条件，而STAT1与STAT2的异源二聚化已被证明干扰素信号传导具有正面或负面的影响。STAT二聚体在细胞因子功能中起着至关重要的作用，但在细胞因子诱导的磷酸化之前的二聚化知识仍然不完整。

尤其是对于STAT家族中的异源相互作用和体内情况，知识仍然不足。为了填补这些知识空白，系统地探索活细胞中STATs的同型和异型相互作用库。基于STATs是核质穿梭蛋白，可以通过核孔与核孔蛋白直接接触，自由地穿越核孔的软扩散屏障。

这导致STATs通常在细胞内均匀分布，而对于STAT1和STAT2，标记可转移的携带依赖性核定位信号，将它们转移到核或细胞质中。信号标记变异体作为鱼饵，吸引共同表达的测试蛋白如果发生结合相互作用，它们在鱼饵蛋白的区域内共定位，用于探测整个STAT家族内细胞中的同型和异型结合相互作用。

窗体顶端

窗体底端

未激活的STAT蛋白是能够在细胞核和细胞质之间穿梭的蛋白，这是通过直接与核孔蛋白和其他载体介导机制实现的。在细胞中，它们表现出近全细胞分布，即使在将C末端标记为荧光标记蛋白，如mEGFP之前也是。

STAT2与其他STAT蛋白的近全细胞分布略有不同；它由于其C末端转录激活域具有强大的核外转运活性而在细胞质中积累。具有截短转录激活域的STAT2变体显示出严重减少的细胞质积累，采用了与其他STAT家族成员更相似的分布方式。

二 预测潜在STAT蛋白质活性调控的多样性

将转移性异源核外转运信号和核内转运信号添加到野生型STAT蛋白中，可以将诱饵蛋白引导到细胞质或细胞核中，两个经过充分鉴定并且高活性的信号，来自蛋白激酶A抑制剂的NES和来自猴病毒40大T抗原的NLS。这些与核转位有关的特性可能使STAT蛋白能够改变与其相互作用的蛋白的定位。

相互作用的强度对于是否能够检测到共定位的影响。目前关于未磷酸化STAT二聚体形成的数据主要是定性的，然而平衡沉淀研究表明未磷酸化的STAT1和STAT3形成高亲和力的同源二聚体，它们的Kd值均在低纳摩尔范围内。

二聚体界面的结构和突变研究已经确定了保守的N端和其中的关键锚定残基对于未磷酸化二聚体的组装至关重要。缺少N端或关键残基的未磷酸化STATs保留了核质穿梭的特性，它们的亚细胞定位与野生型相比几乎没有区别。这些突变使它们基本上成为单体，因为对N端缺失或残基F77突变的STAT1进行的定量分析显示其结合亲和力下降了100多倍。

对于STAT3，L78残基的突变同样导致未磷酸化的二聚体在活细胞中解离，经由Förster共振能量转移。已知结果使用野生型和突变型STAT1和STAT3作为阳性和阴性对照，以测试STAT蛋白的共定位是否可以作为它们在细胞内二聚体形成的可靠指标。

NES-融合的STAT3与野生型STAT3的共表达确实导致它们在细胞质中共定位。如果使用单体STAT3-L78R突变体，无论STAT3-NES是否存在，它都会显示出细胞内分布的无差别，共定位丧失。

野生型STAT1与NES在细胞质中共定位，暗示其同源二聚体化。检验二聚体化是否也会发生在细胞核中的STAT1虽然在细胞核中，表明二聚体化不仅限于细胞质区域。测试一个破坏二聚体化的突变对于STAT1同源二聚体的影响，使用突变体STAT1，它与野生型STAT1不同，F77A突变体与共表达的STAT1不聚集在细胞核中，而是保持泛细胞内分布，类似于STAT3，再次呈现单体STAT的预期行为。

确定测试蛋白无法与诱饵蛋白共定位是由于二聚体形成不足，使用量化荧光成像来确定测试蛋白和诱饵蛋白的相对表达量。如果诱饵变异体的表达量低于等摩尔水平或高于测试蛋白的浓度超过4倍，则忽略这些细胞进行共定位分析。

三 识别潜在STAT蛋白质的同源二聚体和异源二聚体

其他五种STAT蛋白的同源二聚化，将STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6与其相应的NES标记的对应物共同表达。STAT6未能在细胞质中积累，与STAT4、STAT5A和STAT5B形成鲜明对比，后者与它们的NES标记相互作用并共定位。计算10-30个细胞的Pearson相关系数来量化每个实验的共定位程度。

将同源二聚体的数值进行了总结，STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A和STAT5B的Pearson相关系数均为0.94或更高，表明由于稳定的同源二聚化，共定位接近完全。STAT6的共定位显著下降，其rP值仅为0.41。

评估STAT2的同源二聚化，使用具有强烈减少内在核外转运活性的C末端截短变体STAT2ΔC。C末端需要用于STAT2的高效构成性核外转运，这个区域通常似乎在USTAT的二聚化中是可有可无的，包括使用STAT1和STAT2作为诱饵证明STAT2和STAT1的异二聚化。

将C末端截短的STAT2突变体与野生型STAT2共同表达，以探究同源二聚化。观察到不完全的细胞质共定位，以及与其他STAT家族成员形成稳定二聚体的相关系数比不互作的单体STAT6高。

为了检查其他五种STAT的同源二聚体化，将STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6与它们各自的NES标记相伴侣。STAT6无法在胞质中积累，STAT4、STAT5A和STAT5B与它们的NES标记等位物共定位。

STAT6的表现则明显不同，它没有胞质共定位，因此rP值仅为0.41。为了评估STAT2的同源二聚体化，使用了C端截短的变异体STAT2ΔC，该变异体具有强烈降低的内源性核出口活性。

1. 端在STAT2的有效构成性核出口中是必需的。该区域似乎可被省略用于STATs的二聚体化，包括使用STAT1-NES和STAT2作为引子证明的U-STAT2ΔC和U-STAT1的异二聚体化。

STAT2突变体与野生型STAT2一起共表达，以探究U-STAT2同源二聚体化。观察到不完全的胞质共定位和相关系数，该值与其他STAT家族成员的稳定二聚体相比显著降低，但高于不相互作用的单体STAT6。

四 潜在STAT蛋白质的自组装

未磷酸化的STAT二聚体采用一个与N-端交互有关的反向平行构象 。N-端的缺失，甚至是单个N-端点突变，都导致二聚体的解离。对于STAT1来说，N-端残基苯丙氨酸77和亮氨酸78被证明是组装未磷酸化二聚体的关键，亮氨酸78也是STAT3和STAT4 的关键残基，STAT2和STAT5B的同源N-端残基突变，以研究哪些未磷酸化的STAT二聚体具有相同的N-端交互依赖性。

所有七种同源和异源二聚体在突变相同的N-端侧链后都不稳定，U-STAT二聚体采用相似的N-端介导构象。对于U-STAT1：STAT2异源二聚体，突变的解离效应相对较弱，这表现在其rP值的相对降低。这表明这种STAT二聚体采用了一个异常稳定的构象。

比较不同U-STAT二聚体之间的结合强度，表达了带有不同定位信号的STAT蛋白。PKI NES信号被认为是更强的信号，因为在同时添加这两个信号时，蛋白质会积累在细胞质中。

将不同的USTAT二聚体暴露于这些相反的转位信号中，揭示不同二聚体之间结合强度的差异。五种同源二聚体和异源二聚体表现出相同的行为，即根据其相应的定位信号定位于细胞核或细胞质，并且二聚体会解离。U-STAT1二聚体独特地抵抗解离，即使STAT2定位于细胞核，仍然会在细胞质中共定位。

当STAT2的热点界面残基L82突变为丙氨酸时，U-STAT1二聚体的结合强度降低，导致STAT1和STAT2完全分离。C端修饰的STAT2可以去除其不为人知的NES活性，并用已知的PKI NES活性替换。

使用药物抑制剂leptomycin B来阻断STAT2通过CRM1介导的核出口活性，没有共表达STAT1-NLS，两个STAT仍然保持在细胞核中共定位。leptomycin B处理导致STAT2分布在全细胞而不是在细胞核内积累，这与持续的非载体介导的核出口能够抵消STAT2的固有细胞核内定位活性一致。未磷酸化的STAT1和STAT2的异二聚体是通过特别强的结合相互作用来区分的。

蛋白搭载分子的结合强度不同是与体外测量的结合亲和力和在活细胞中观察到的运输活性通常很相关。非载体蛋白的相互作用也可能起到决定性的作用，强度平衡通常对于确定可溶性蛋白的稳态定位至关重要。在形成二聚体的STAT蛋白中添加了一个对立的信号序列。

五 结论

未磷酸化的STAT1和STAT2之间有着异常强的结合相互作用。全长STAT2同源二聚体或与STAT1形成的异源二聚体的体外结合亲和力。它们的N-域形成的异源二聚体具有非常高的亲和力，其解离常数在低纳摩尔范围内，超过全长U-STAT1同源二聚体的亲和力。同源的STAT2 N-域相互作用则弱了数千倍，在细胞中观察到的U-STAT2同源二聚体的缺失相符。

STAT蛋白从潜在转变为活性转录因子是细胞因子信号传导的关键。在它们受到信号诱导的酪氨酸磷酸化后，细胞因子特异性的STAT同型和异型二聚体的组装标志着潜在蛋白转变为转录激活因子的关键步骤。相比之下，潜在STAT蛋白的构成自组装及其与激活STAT蛋白的功能关系还不太清楚。

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