科学家实现单细胞蛋白质分泌时间分辨评估，弥补单细胞技术的不足

现如今，随着单细胞多组学分析技术的发展，科学家们在细胞分子异质性上的研究也更加深入。

在多细胞生物中，细胞间的差异性非常大，很难发现两个在功能、形态等各方面完全相同的细胞，因此需要从单细胞级别入手，对其异质性进行分析。与此同时，包含单细胞基因组学、表观遗传学、转录组学等在内的多组学技术，已经能够实现对单个细胞性质和功能的全面研究。

尽管如此，单细胞多组学分析技术依然存在缺陷与不足。比如，要想进一步深入地了解细胞发挥的功能，一定要知道其所能分泌的功能蛋白，还有强度和时序性，及其是如何介导细胞间通讯和调控的。而一个现实的问题是，上述技术目前还无法实现对功能性蛋白分泌的测量。

为了解决上述问题，近期，来自新加坡国立大学的研究团队开发了一种基于高通量测序的方法（time-resolved assessment of protein secretion from single cells by sequencing，TRAPS-seq），通过对单细胞的蛋白质分泌进行时间分辨评估，实现在单细胞水平上对分泌蛋白、细胞表面表型标记和转录组的同时测量。

干扰素 γ（Interferon gamma，IFNγ）、白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）等 Th1 细胞因子是促进抗原特异性免疫反应的关键因子。但相关领域的科研人员，对其在时间和强度上的分泌模式，以及潜在的细胞和分析特征，还未曾清晰探明。

基于上述方法，该团队选择了细胞活化后的三个时间点（1 小时、6 小时和 16 小时），并一一研究了由抗 CD3/CD28 微球激活的人淋巴细胞的细胞因子分泌情况。

他们发现，细胞因子的蛋白分泌和基因表达在时间和强度方面存在差异。也就是说，在早期激活（0-1 小时）期间，细胞因子 mRNA 的表达先于分泌蛋白，这反应了蛋白从细胞中翻译和分泌需要额外的时间；在长期激活（6-16 小时）期间，分泌 TNF 或 IFNγ 的细胞比例和基因表达水平随时间的推移而增加。并且，表达 IL-2 mRNA 的细胞比例有所增加，分泌 IL-2 的细胞比例保持相对稳定。

图丨TRAPS-seq 能够对单细胞蛋白质分泌、表型和转录组进行综合分析（来源：Nature Methods）

总的来说，TRAPS-seq 将单细胞功能蛋白的分泌加入到多组学技术中，能为功能性细胞的发现提供最直接的证据，进而为基础研究和应用研究提供良好的思路和解决方案。

“我们可以用该方法发现一些功能性的超级细胞，抑或是功能紊乱的缺陷细胞，为免疫调节或细胞免疫治疗等领域带来研究和应用价值。”新加坡国立大学博士后吴同金表示。

图丨相关论文（来源：Nature Methods）

2023 年 4 月 10 日，相关论文以《通过测序对单细胞蛋白质分泌的时间分辨评估》（Time-resolved assessment of single-cell protein secretion by sequencing）为题在 Nature Methods 上发表[1]。

吴同金为该论文的第一作者，新加坡国立大学曹立峰（Cheow Lih Feng）助理教授担任论文的通讯作者。

(来源：Technology Innovations for Systems Biology，https://sites.google.com/site/cheowlflab）

如上所说，该研究最大的亮点是通过测序对单细胞的蛋白质分泌进行时间分辨评估。这其中包含三个关键问题。

第一是如何让蛋白质可测序。一般来说，高通量测序（Next Generation Sequencing）测的是 DNA、RNA 等核酸序列，而对蛋白质进行检测，通常要在使用荧光抗体的基础上，通过荧光显微镜和流式细胞分析技术进行。那么，要想实现蛋白质可测序，需要将荧光抗体变为 DNA 标记的抗体，并对其进行定性分析，这样就能采用测序的方式，读取和分析蛋白质的分泌。

第二是如何在单细胞水平上，将分泌蛋白和分泌它们的细胞联系起来。在这方面，该团队在每个细胞表面修饰了一些抓取分泌蛋白的“把手”，以便抓住分泌出的细胞因子，然后再通过 DNA 标记的抗体对其进行直接识别。

第三是如何达到时间分辨。“要实现时间分辨主要有两种方法，一种是在不同的时间点分析不同的样品，通过测序得到数据之后再进行拟时序分析（Pseudotime analysis），但这样并不能真正地反应一个细胞在这个时间点和下个时间点细胞分泌的情况变化。”吴同金解释说。

研究人员先通过用代表不同时间点的 DNA 标签标记相应的检测抗体，然后在两个不同的时间点下对其进行检测，最后通过数据分析区别出两个时间点，这样能够实现真正的时间分辨图。

在这项研究中，该团队仅研究了三个功能性细胞因子。而由于细胞间的差异性很大，许多细胞都可以分泌多种细胞因子，因此接下来他们想尝试提高该方法的多重性，实现对十个甚至几十个分泌蛋白的同时检测，最终推进这项技术在更为广泛的领域获得应用。

参考资料：

1. Wu, T., Womersley, H.J., Wang, J.R. et al. Time-resolved assessment of single-cell protein secretion by sequencing. Nature Methods 20, 723–734 (2023). https://doi.org/10.1038/s41592-023-01841-y