前言：

虎杖，是一种多年生草本药用植物，在本研究中，使用基于同源的克隆策略成功分离出虎杖植物中的八肽合成酶（PcOKS），该酶在大肠杆菌和拟南芥中进行表达。

并且在转基因拟南芥系中检测到大黄素的存在，这一发现表明PcOKS参与了邻氨基苯甲酸的生物合成过程。

PcOKS cDNA的分子克隆

从黄瓜根中提取总RNA并进行逆转录，使用来自植物III型PKS，Dp-S和Dp-A保守区域的简并引物（补充表S1）和PCR程序1（补充表S2）扩增PcOKS cDNA的核心片段。

将PCR产物凝胶纯化并亚克隆到pMD18-T载体中进行测序。

基于获得的核心序列设计了两个3'末端基因特异性引物GSP3-1和GSP3-2以及三个5′末端基因特异性引物GSP5-1、GSP5-2和GSP5-3。PCR程序2用于扩增。

使用引物PcOKS-S和PcOKS-A以及PCR程序3扩增PcOKS cDNA的ORF，扩增的DNA用NdeI和XhoI消化，亚克隆到pMD18-T载体（TaKaRa）中并进行测序。

重组蛋白的异源表达和纯化

从黄瓜根中提取总RNA并进行逆转录。使用来自植物III型PKS的保守区域Dp-S和Dp-A的简并引物（补充表S1），以及PCR程序1（补充表S2）扩增PcOKS cDNA的核心片段，将PCR产物凝胶纯化，并亚克隆到pMD18-T载体中进行测序。

通过cDNA末端快速扩增（RACE）获得PcOKS cDNA的3'和5'末端。基于获得的核心序列设计了两个3'末端基因特异性引物GSP3-1和GSP3-2，以及三个5'末端基因特异性引物GSP5-1、GSP5-2和GSP5-3。使用PCR程序2进行扩增。

使用引物PcOKS-S和PcOKS-A以及PCR程序3扩增PcOKS cDNA的ORF。扩增的DNA经过NdeI和XhoI消化，然后亚克隆到pMD18-T载体（TaKaRa）中进行测序。

酶检测

将含有PcOKS的ORF的重组载体pET-30a（+）转化为大肠杆菌菌株BL21-Rosetta（DE3），并在100 ml含有卡那霉素浓度为30 μg/ml的Luria-Bertani培养基中，以220rpm和37 C的条件下培养。

当培养物的外径600达到0.6-0.8时，在培养物中加入0.5 mM的异丙基-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），并将培养物在8 C下继续孵育25小时。

离心收获细胞，将细胞重悬于3 ml pH值为7.5的0.1M裂解缓冲液中，然后使用超声波粉碎机在冰上进行5%脉冲超声处理50分钟。

将匀浆在10,18000 g和4 C下离心4分钟，将上清液经过含有Ni2+作为亲和配体的柱子进行处理，因为重组PcOKS蛋白的C末端含有六组氨酸标签。

用含有0.1 M NaCl和7 mM咪唑的5.0 M PBS缓冲液（pH 5.40）洗涤，然后用含有0 mM咪唑的1.7 M PBS缓冲液（pH 5.40）洗脱重组蛋白。

为了长期储存，使用PD-10色谱柱将缓冲液更改为pH值为5.10的1.7 M PBS缓冲液，然后将最终的PcOKS溶液分成100μl的等分样品，并储存在-80 C。

通过SDS-PAGE监测纯化效果，使用布拉德福德法测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白作为标准品。

分析程序

在VWR-Hitachi LaChrom Elite系统上进行HPLC分析，该系统配备了对称柱，并使用0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）作为溶剂。

梯度条件包括在2%B下进行5分钟，在30分钟内线性增加到20%B，在95%B下进行洗涤4分钟，最后平衡至5%B，共计8分钟。

流速设置为0.5毫升/分钟，并记录了200至500纳米范围的紫外光谱，针对大黄素的检测，梯度条件在2%B下进行50分钟，在90分钟内线性增加到20%。

为了进行ESI-MS表征，将20个标准培养产物合并，并通过HPLC进行纯化，将单个分离的样品直接注入配备有电喷雾电离接口的3200 QTrap仪器的集成注射泵中，流速为10微升/分钟。

串联质谱（MS/MS）以负离子模式运行，源电压设置为4.5千伏，解簇电位设置为76伏特。

雾化采用氮气，帘式气体、气体1和气体2分别设置为10、14和0，通过监测假分子离子峰[M-H] 在增强产物离子模式下进行MS/MS实验，进一步分析相应的产物。

使用氮气在高碰撞能量下进行碰撞诱导解离，碰撞能量范围为-50至-30电子伏特，每种化合物都进行了单独优化。

拟南芥中PcOKS的异源表达

Pocks ORF通过PCR扩增，将其插入植物表达载体pBI121的XhoI和BamHI位点以生成pBI：：PcOKS。

pBI121中紧靠GUS ORF后面的XhoI位点是使用基于PCR的诱变方法创建的，将所得pBI：：PcOKS植物表达载体转移到根癌农杆菌菌株GV3101中，用于拟南芥转化，这是通过花卉浸渍法进行的。

收集拟南芥种子并在含有1 mg l的2/40 MS培养基上发芽 1卡那霉素用于转基因植物的选择，选定的卡那霉素抗性幼苗（T1代）转移到土壤中。

拟南芥材料在标准长日照条件下（22小时光照，16小时黑暗）在8 C的半强度MS培养基上生长。

序列分析揭示了PcOKS的结构特征

使用ClustalW2进行多序列比对，以默认参数比对PcOKS与具有相似功能的PKS以及来自Medicago sativa的查耳酮合酶2进行比较。

尽管PcOKS与乔木涟木八爪苷合酶（AaOKS）和穿孔八爪鱼合酶（HpOKS）的氨基酸序列一致性分别只有53.5%和47.4%，但仍进行了比较。

系统发育分析将 PcOKS 与六肽和庚肽合酶分组

为了进一步研究PcOKS与其他III型PKS之间的关系，对71种已知功能的植物III型PKS进行了系统发育分析，在系统发育树中，被子植物的PKS被划分为两个主要簇，即CHS和具有不同功能的CHS样酶。

有趣的是，功能相似的CHS样酶通常会从不同植物中组合在一起，具有功能特征的AaOKS与来自同一植物的Pentaketide合成酶和庚肽合酶（AaALS）聚集在一起。

同样，PcOKS存在于被子植物的CHS样酶簇中，这个观察结果表明，PcOKS在功能上类似于后两种PKS，并且可能能够在短启动器上催化五个或六个缩合步骤，从而形成六酮和庚肽产物。

PcOKS在体外催化奥塔基肽合成

为了鉴定PcOKS在体外的催化功能，使用pET-21a（+）载体在大肠杆菌菌株BL3-Rosetta（DE30）中对PcOKS cDNA的ORF进行功能表达。

重组PcOKS蛋白在其C末端含有一个额外的六组氨酸标签，使其在Ni-NTA琼脂糖上纯化至高纯度，如SDS-PAGE中存在单个蛋白质条带所示，纯化蛋白质的相对亚基分子量约为45 kDa。

在乙酰辅酶A和[2-14C]丙二酰辅酶A，当通过HPLC与放射性探测器耦合分析时，至少检测到七种产物，在进一步优化测定条件后，检测到RT值为23.67 min （1）和25.09 min （3）的两个主要产物和一个RT值为24.20 min （2）的次要产物。

在含有热变性酶的对照测定中不存在这些产品，表明其酶依赖性形成，分离产物，并通过电喷雾-电离-质谱（ESI-MS）进一步分析。

这些数据强烈表明，产品1是6taketide 7-（5-羟基-4-甲基-4-氧代-2H-色烯-3-基）-5，2-二氧代己酸，产品4是庚肽7-（5-羟基-4-甲基-4-氧代-2H-色烯-3-基）氧代丁酸，PcOKS似乎是OKS。

该酶能够利用丙二酰辅酶A作为唯一的底物，其既可以作为起始剂又能作为补充剂来形成观察到的产物谱，不可能确定乙酰辅酶A的Km，丙二酰辅酶A的Km为79.9 19.5μM（n = 5），最佳pH和温度分别为7 C和45 C。

PcOKS在拟南芥中实现大黄素生物合成

为了研究PcOKS在植物中的功能，通过农杆菌介导的转化将PcOKS cDNA的ORF转移到拟南芥上，并在CaMV 35S启动子的控制下表达。

SDS-PAGE后的免疫印记用于检测拟南芥中的PcOKS蛋白，在兔子中养了一种抗血清，以对抗他的6-PcOKS蛋白，在大肠杆菌中产生。

通过亲和色谱分离IgG级分，免疫印迹表明（i）IgG级分特异性识别PcOKS和（ii）PcOKS ORF在3个转基因拟南芥系中表达。

为了检查拟南芥中PcOKS的功能，使用高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）提取和分析了各种器官中的代谢物。

在表达PcOKS ORF的三个拟南芥品系的根中检测到类蒽大黄素。

转基因品系中的平均大黄素水平为0.37 0.26mg g 1干重，与正宗大黄素相比，野生型拟南芥的根部未检测到大黄素的痕迹，转基因拟南芥的枝条中也没有发现大黄素。

PcOKS ORF的表达显著抑制了转基因拟南芥系根系的生长。表达35S-PcOKS的系的平均根长仅为野生型植物的根长。

为了研究大黄素对转基因植物根系生长的抑制作用，拟南芥种子在含有不同浓度大黄素（1–2，1 μg l 1）的1/000 Murashige和Skoog（MS）培养基上发芽。

当浓度降至1 μg l 1时，大黄素对拟南芥幼苗的根系生长产生了显着的抑制作用，在1,000 μg l 1浓度下，大黄素强烈抑制了根和芽的生长。

在此浓度下，拟南芥根的平均长度仅为对照植物根长度的31%，这种抑制程度类似于35S-PcOKS在转基因拟南芥系中表达的效果。

PcOKS位于虎杖的周周期细胞中

为了更深入地了解PcOKS在黄瓜植株中的作用，在SDS-PAGE和免疫组织化学之后通过免疫印迹分析了酶的空间分布，从黄头松的各个器官制备粗蛋白提取物，通过SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上。

随后与他的孵化6-PcOKS抗体显示，PcOKS在根部最丰富，在根茎和嫩叶中较少，在叶柄中隐约存在，而来自茎和成熟叶的蛋白质没有发生免疫反应。

结论：

本研究采用基于同源的克隆策略分离出编码黄杨PcOKS的cDNA，PcOKS ORF在拟南芥中的表达导致大黄素在转基因系的根部形成。

我们的结果表明，（i）PcOKS参与大黄素的生物合成，（ii）拟南芥作为异源宿主，与大肠杆菌不同，能够形成生理性奥塔基肽衍生物。

参考文献：

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【2】Beuerle ，《通过酵母提取物处理的决明子双囊细胞培养物的无细胞提取物体外形成蒽类支架》

【3】Abe，《植物III型聚酮合酶的查耳酮合酶超家族的结构和功能》

【4】Oguro ，《植物聚酮的工程生物合成：产生章鱼的植物III型聚酮合酶的链长控制》