前言：

真核生物和光合微生物面临着一个核心问题，即细胞膜中存在多个包含特定亲脂性跨膜蛋白（IMP）的子集。将IMP正确定位和插入到特定位置对于维持细胞内稳态至关重要。

一、Get3d蛋白的重要性背景

大多数IMP通过疏水性的α-螺旋跨膜结构域（TMDs）横跨脂质双层，这在生物合成过程中是一个挑战，因为在插入之前它们必须从水相环境中保护起来以避免聚集。IMP的定位信号通常位于第一个跨膜结构域，该信号编码了目标位置，而信号在蛋白质序列中的位置决定了共翻译和后翻译定位的方式。

IMP是特定亲脂性跨膜蛋白的子集，是细胞内维持稳态的关键成分。其中，尾锚蛋白是一种具有单个跨膜结构域的蛋白，作为定位信号，必须在定位之前完全合成并被核糖体释放。

通过翻译伴侣辅助机制被定位到不同的膜结构上，主要通过GET通路实现，其中关键成分是Get3。在GET通路中，Get3在细胞质中捕获TA信号，并依赖ATP水解将蛋白质传递给内质网的膜插入复合物。许多TA蛋白发挥着重要作用，如囊泡运输、蛋白定位和凋亡调控。

光合作用产生能量的生物需要特定的细胞区室和膜结构来完成功能，这增加了将TA蛋白定位到这些膜上的复杂性。例如，叶绿体和其他质体是多膜细胞器，起源于12亿年前的内共生事件，即一个蓝细菌祖先被纳入到早期真核生物中。

可以预期叶绿体中的蛋白定位具有类似于细菌的特征。对叶绿体膜蛋白的定位有很多了解，但目前还不清楚蛋白定位到类囊体膜或内包膜的机制是否存在差异。

二、Get3d的结构和特征

比如SECE2和SECE1，它们是定位在内包膜或类囊体膜上的两个SecE同源物，它们的定位仅依赖于TMD和相邻的C末端残基。最近的研究发现，Get3同源物AtGet3b参与将SECE1定位到类囊体膜，但对于AtGet3b在体内的具体作用仍需要进一步研究。虽然蛋白质因子和具体定位机制尚不清楚，但需要有一种分选机制来区分TA蛋白的特征。

Get3/ArsA折叠家族是在2006年被Pfam发现的，并在2012年由Chartron等人首次讨论。该家族包括来自生命的三个域的同源物，其中一个具有在其C-末端具有α-晶体蛋白结构域（αCD）的独特结构。真菌和后生动物只有一个Get3基因，而植物和蓝细菌则有多个Get3基因。模式植物拟南芥（A. thaliana）具有四个这样的基因，分别是Get3a、b、c和d。

AtGet3a存在于细胞质中，AtGet3b存在于叶绿体基质中，而AtGet3c存在于线粒体基质中。AtGet3a与其他真核生物中细胞质Get3同源物具有相同的功能，即将细胞质内的疏水性TA蛋白定位到内质网膜上，并且敲除AtGet3a会导致明显的表型变化。关于敲除AtGet3b是否会引起表型缺陷存在争议，而敲除AtGet3c并没有观察到表型缺陷。

三、Get3d的进化和生物分布

为了研究Get3d的进化历史，进行了全面的系统发育重建。从Pfam数据库中识别了Uniprot中存在的所有Get3蛋白质，并将它们与已知Get3蛋白质的三维结构进行比对。

使用最大自然方法进行系统发育重建，并通过进行70%的Bootstrap分析来合并分支。可以得到一个关于Get3/ArsA同源物的进化树，展示了它们在生命树上的关系。

在Get3/ArsA同源物的系统发育重建中，我们可以观察到几个不同的支系。首先是ArsA，它主要存在于细菌中，是一种溶解性ATP酶，参与对抗砷中毒的防御。其次是受到广泛研究的细胞质Get3，在真核生物和一些古菌中存在，例如AtGet3a。另一个支系仅限于绿色植物，包括AtGet3b和AtGet3c。

最后一个支系最早出现在绿色和紫色细菌中，然后在蓝藻和绿色植物中广泛分布，包括AtGet3d和具有已解决结构的蓝藻Nostoc sp. PCC 7120（NosGet3d）。这些观察结果可以通过系统发育重建来呈现，展示了这些Get3/ArsA同源物在进化树上的关系。

在序列水平上，Get3d蛋白包含了可以与Get3家族的显著结构单元进行比对的区域。这些结构单元包括P-loop、Switch-I、Switch-II、Get3 motif/TRC40-insert和A-loop。P-loop是一个高度保守的结构单元，具有二聚体内部（或"变异"）Walker A结构。一些Get3d蛋白，如Synechocystis sp. PCC 6803的第二个同源物（Sll0086）以及绿硫菌和非硫菌的Get3d，具有保守的Switch I、Switch II和A-loop区域。

更常见的是像AtGet3d和NosGet3d这样的同源物，它们具有退化的催化残基，包括不同的Switch I环和缺失的A-loop。与相关的ArsA蛋白不同，Get3同源物的Get3 motif/TRC40-insert区域具有保守的疏水性。在Get3d家族中，用于协调Get3二聚体界面处的特征CXXC结构单元也缺失了。以上这些特征可以通过序列比对来观察和分析，揭示了Get3d蛋白与Get3家族其他成员之间的结构差异。

虽然尚未经过实验证实，但有关AtGet3d的细胞定位的推测已经进行了研究。根据这些推测，像AtGet3d这样的基因在基因的内共生转移过程中从祖先蓝藻中获得了一个绿色体定位信号，并被转移到植物基因组中。

通过计算方法的预测支持这一观点，预测认为AtGet3d定位于叶绿体基质，其定位的可能性约为91%。另外，还有很小的可能性（约5%）认为它定位于类囊体间隙。尽管尚未进行实验证实，但这些推测为进一步研究AtGet3d的细胞定位提供了一定的方向。

四、Get3d相互作用的分析

为了实验确认AtGet3d的定位，研究人员采用了农杆菌介导的方法，在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中表达AtGet3d。他们构建了一个带有绿色荧光蛋白（GFP）连接的Get3d基因的载体，其中包含或不包含预测的叶绿体转运肽，作为C端融合蛋白。

通过将这些载体介导插入到烟草基因组后，研究人员可以观察到表达的Get3d的定位。他们使用荧光显微镜观察烟草叶片，对于包含转运肽的完整Get3d基因，GFP荧光与内在的叶绿素自发荧光共定位，这表明AtGet3d定位于叶绿体。

无法通过这个实验区分AtGet3d定位于叶绿体基质还是类囊体腔。对于缺少转运肽的Get3d，GFP信号显示为明显的斑点图案，与明显的亚细胞结构不相关，在细胞质和细胞核中的定位也与正常情况不一致。这些实验结果证实了叶绿体定位信号的预测。

为了解析AtGet3d的晶体结构，研究人员构建了一个不含叶绿体转运肽的载体，并通过凝胶过滤层析纯化了同源二聚体形式的蛋白。尽管序列上缺失了ATP结合的残基，但只有在ADP存在的条件下才获得了晶体衍射。最终的晶体在特定条件下生长并收集了完整的原始数据集，分辨率为2.0 Å，在P 1 21 1空间群中。

研究人员使用蓝藻NosGet3d的同源二聚体作为分子置换的模板来得到相位信息。结构分析显示，同源二聚体在结构中呈现不对称单元。晶体的R因子为0.22，自由R因子为0.26。在推测的活性位点中未观察到核苷酸的密度，但在结构中出现了明显的无机磷酸盐和Mg2+离子的密度。部分残基在结构中无法解析出来，如在Monomer A中的残基250-260、330-331和378-382，以及在Monomer B中的残基252-261和380-384。

五、研究分析

在AtGet3d的结构中，α螺旋结构域（CBD）被额外的螺旋包围，而在已发布的Nostoc中的Get3d结构中没有观察到这些螺旋结构。研究人员使用与Nostoc同源体的结构因子（PDB ID：3IGF）查看了其电子密度图。通过这个密度图，清晰地识别出与AtGet3d的螺旋结构域相一致的额外密度。在这个密度中，研究人员构建了41个氨基酸残基，并进一步优化了NosGet3d的结构。

NosGet3d的结构与AtGet3d的结构非常相似（主链的RMSD = 2.33 Å）。与AtGet3d类似，NosGet3d的疏水腔中也有一些未被识别的密度。一个显著的区别是，在NosGet3d中，包围CBD的螺旋结构与腔室底部的距离比AtGet3d更远，导致了一个更大的疏水腔。

Get3d的一个独特特征是位于其C-末端的α晶体蛋白结构域（αCD）。该结构域具有典型的α晶体蛋白折叠，由七个反平行β链构成的紧密β夹层结构。尽管折叠结构是保守的，但该结构域与其他α晶体蛋白结构域和相关的小热休克蛋白（sHSPs）在序列上的相似性很低，并且缺少典型的α晶体蛋白结构域二聚化和寡聚化的重要特征，比如在大多数植物、酵母和细菌的α晶体蛋白结构域/sHSPs中发现的包含β6的环状结构。没有发现大多数α晶体蛋白结构域的二聚体或更高级别的寡聚体的证据。

AtGet3d和NosGet3d保留了ATPase活性所需的组分，包括P-loop（Walker A基序），它识别底物ATP的α-和β-磷酸根，类似于真菌Get3中观察到的情况。Get3属于SIMIBI类核苷酸三磷酸酶（NTPase）的Mrp/MinD亚家族，其特点是具有内二聚体（或称为“异质”）的Walker A基序。

内二聚体Walker A基序包含一个保守的赖氨酸（GxxGxGK[ST]），用于介导磷酸根的结合。在ATP结合时，内二聚体Walker A基序中的第二个保守的赖氨酸（GKGGhGK[ST]）可以跨越二聚体界面，促进催化反应。

在Get3d蛋白中，这个赖氨酸稳定了活性位点中通过水介导的亲核攻击γ-磷酸根时产生的负电荷积累。在AtGet3d和NosGet3d中，这个赖氨酸保守存在，并参与底物结合。在NosGet3d中，这个赖氨酸意外地被精氨酸替代，与大多数蓝细菌Get3d同源体有所不同，这表明在该生物体中发生了显著的进化漂移。

六、结论

Get3d的折叠形式与光合作用之间存在紧密的进化联系，尽管相关性已被证明，但这并未完全解释Get3d的功能。虽然目前尚未确定其确切功能，但显然，通过在形成叶绿体的内共生事件中保留其功能的证据，可以推测其在将光能转化为化学能方面具有关键作用。

Get3d的功能可能涉及参与TA蛋白的定位和转运，充当伴侣蛋白或两者兼而有之，类似于细胞质中的Get3蛋白的功能。此外，Get3d也可能具有全新的功能，需要通过识别表型和相互作用伙伴来揭示这个谜题。类似Get3的蛋白质在不同的生物界中广泛存在，这引发了人们对这种折叠形式最早出现的地点和可能角色的疑问。未来的研究将有助于解答这些问题。

参考文献

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