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图形介绍

如何合成：L-色氨酸脱羧酶PsiD启动裸盖菇中精神药物天然产物裸盖菇素的生物合成。其体外生化表征和其结构的计算机建模确定了用于前酶自催化切割的非规范丝氨酸蛋白酶三联征。PsiD的底物柔韧性使其成为生物技术应用的多功能催化剂。

摘要

l-色氨酸脱羧酶PsiD催化代谢级联的第一步，以裸盖菇素为主。裸盖菇是“神奇”蘑菇的主要吲哚乙胺天然产物，也是对抗重度抑郁症的候选药物。

与用于天然产物生物合成的众多磷酸吡哆醛 （PLP） 依赖性脱羧酶不同，PsiD 与 PLP 无关，类似于 II 型磷脂酰丝氨酸脱羧酶。在这里，我们报告了裸盖菇PsiD的体外生化表征以及PsiD结构的计算机建模。预测了用于前蛋白自催化切割的非规范丝氨酸蛋白酶三联征，并通过定点诱变进行了实验验证。

概况

裸盖菇素是裸盖菇的主要天然产物，摄入后会引起精神亢奋。这种4-O-磷酸化色胺是实际精神活性化合物psilocin的前体，其作为各种血清素（5-羟色胺，5-HT）受体的部分激动剂，主要是皮质5-HT2受体。

目前，裸盖菇素作为候选药物正在复兴。II期临床试验的结果表明，在治疗重度抑郁症和难治性抑郁症方面具有很高的疗效。因此，美国食品和药物管理局授予该化合物“突破性疗法”地位。其他涉及裸盖菇素的临床试验调查了其对癌症相关存在窘迫和物质依赖性的使用。

先前鉴定了在裸盖菇中催化裸盖菇素生物合成的酶，这使得这种未来药物的生物催化生产成为现实。程序包括完全酶促合成，使用从4-羟基-l-色氨酸或4-羟基吲哚和L-丝氨酸开始的步经济路线，以及合成西洛辛的酶促磷酸化。或者，报道了携带生物合成基因的重组微生物的体内方法。

裸盖菇素的细胞生物合成和体内或体外的生物催化途径都是由L-色氨酸脱羧酶PsiD引发的。这种门户脱羧酶充当初级和次级代谢之间的界面，通常依赖于吡哆醛5'-磷酸（PLP）作为假体基团。

相比之下，PsiD 对于次级代谢是不寻常的，因为它与磷脂酰丝氨酸脱羧酶 （PSD） 有关。这些是独立于PLP的酶，可自催化地将C端部分（称为α链）从酶原上切割出来。在切割过程中，α链经历其N末端丝氨酸转化为pyruvoyl（PYR）残基，其作为内在假体基团。裂解后，酶具有催化能力，并且可以在共价结合的PYR的α-羰基碳和l-Trp底物的伯胺之间形成希夫碱。

为了更深入地了解裸盖菇素组装第一步的生物化学，从而支持生产这种未来药物的生物技术方法，我们在这里介绍P.cubensis PsiD的体外和计算机表征。

结果和讨论

L-色氨酸脱羧酶PsiD的表征

重组P.cubensis PsiD 被生化表征为六组氨酸融合蛋白。通过使用UHPLC-MS检测产物色胺进行色谱测量其酶活性。最佳周转发生在pH 6.6和33-36 C之间。PsiD 动力学遵循典型的 Michaelis-Menten 对l-Trp 浓度增加的响应，表明KM值为 0.10 0.02 mm和k猫的1.74 0.11 秒 1对于这种氨基酸。

这转化为催化效率（k猫/KM） 的 17.4 103米 1s 1.这些值与CsTDC的值相当，CsTDC是一种生化表征的担子菌脱羧酶，可选择l-Trp。我们还通过在磷酸盐缓冲液（pH 6.6）中储存4 C后的活性来测试PsiD的稳定性。即使在24天后，酶仍保持全部活性。

其他芳香族l-氨基酸（Tyr，Phe，His）,l-Trp的苯并噻吩类似物以及一个小的天然和非天然l-Trp衍生物库，在位置4，5和6取代，作为底物进行测试。为了询问PsiD的立体特异性，d-Trp也被包括在内。

UHPLC-MS的后续分析表明，PsiD具有严格的立体特异性，因为它仅在可忽略不计的痕迹中翻转d-Trp。同样，l-His也没有被接受，而l-Tyr和l-Phe导致少量营业额（与l-Trp相比为4%和9%）。孵育2小时后，相对于l-Trp作为天然底物，形成116%，102和72%的4-，5-和6-甲基-l-Trp产物。

位置4和5处的羟基分别导致64%和91%的周转率，即C-5处的无极性甲基和极性羟基取代基都没有显著改变酶转换。5-氟-l-TRP在所有测试基材中翻转得最好（129%）。对于硫类似物苯并[b]噻吩-3-基-l-丙氨酸，发现56%的周转率。

PsiD的结构特征

丙酮酰依赖性PSD的一个突出特征是前酶的自催化裂解成较大的N端β链和较小的C端α链。在细菌或线粒体I型PSD中，切割发生在LG处|ST基序 而在II型真核PSD中，4 kDa C端α链的自催化裂解发生在GG上|SX共识序列X=S在裸盖菇属中。

在变性SDS凝胶中，分离了PsiD的49 kDa β链和4 kDa α链，但晶体结构为7cnw磷脂酰乙醇胺加工大肠杆菌 PSD-I（ECPSD，残基 1-287，结晶版本中没有最后 36 个残基）表明，携带催化活性 PYR 残基的小α链肽仍然是核心 PSD 反平行β片结构的组成部分。

天冬氨酸定位和P. cubensis PsiD AlphaFold模型中的关键残基。该模型包括α链作为催化域核心的反平行β片的组成部分。所有天冬氨酸，包括可能的PSD-I共识位点，都远离结合位点。完成非经典催化三元组最有可能的候选者仍然是E242。柔性N端的建模尚不确定。EMS：内膜系统靶向序列。

在没有PSD-II晶体结构的情况下，我们产生了能量最小化的AlphaFold（AF）。通过AF ColabPro门户在单独的α链和β链中提交其序列，自催化切割的P. cubensis PsiD模型。

尽管ECPSD和PsiD之间的序列比对适中（23%的同一性，具有多个大间隙），但二级结构匹配将PsiD模型的核心和ECPSD的骨干r.m.s.d.叠加为2.2 Å。ECPSD G253和S254（称为PYR254）之间的解离映射到PsiD中的G402和S403上。

与单链PsiD前酶模型（未显示）相比，PsiD模型中的链断裂允许结构松弛，该模型由G402和S403之间的短肽键限制和构象应变。松弛分裂链 PsiD 模型 （14 Å） 的 Cα 原子之间的距离几乎与 ECPSD 晶体结构 （13 Å） 中 G253 和 PYR254 之间的 Cα 距离相同，证明了 AF 模型（无需任何结构模板输入）在切割位点周围的合理性。

PSD含有Asp-His-Ser（DHS）的经典丝氨酸蛋白酶催化三联征。丝氨酸充当亲核试剂，破坏剪刀肽键，导致分离的α链和β链。

此外，丝氨酸残基转化为吡喃酰残基并参与随后的脱羧反应。ECPSD中的DHS三联征被报告为D90或D142，H144和S254。残基 H144 和 S254 在结构上几乎完美地映射到 PsiD 中的 H296 和 Ser/PYR403。

然而，PsiD模型在结构上没有接近ECPSD D90或D142的天冬氨酸。距离H296 11 Å的最接近的天冬氨酸是D211、D212和D394（表S1），但它们本身距离ECPSD D90超过12 Å。完成DHS催化三元组的远程可能性仍然是D147，直接靠近β单元终端G402。

序列基序FFXRX6接收12PXD，在PSD-I中保守并鉴定催化Asp，在PSD-II PsiD中不存在。以FFXRX开头的最接近的PsiD序列仅显示D222和D224，或D251和D256作为不太可能的候选者。

两对天冬氨酸都暴露在溶剂中，位于PsiD模型的相对两侧，距离结合位点超过20 Å。PsiD模型与ECPSD的叠加揭示了PSD-I催化天冬氨酸D90与PsiD中的E242几乎完美的叠加，与催化His144/296和Ser403 / PYR243的距离几乎相同。因此，最有可能完成非经典催化三联征EHS的候选者是 E242。

ECPSD晶体结构显示（βα）2埋入界面面积为 1800 Å 的二聚体指示体外生物二聚体。预测的AF二聚体PsiD模型（未显示）预测埋藏表面积为 1100 Å2，在晶体触点和专性二聚体界面之间的边界处明显较弱。

此外，该模型中两个PsiD分子的排列与实验观察到的（βα）不符ECPSD2中的二聚体排列。尽管催化与核心紧密匹配，PsiD AF模型的整体质量良好，但模型的大部分内容，包括假定的内膜系统靶向序列和C2结构域缺乏实验验证。

PsiD作为PSD-II的功能特异性，作用于小分子靶标，如l-色氨酸脱羧酶，可能与膜相关PSD-I ECPSD中磷脂酰丝氨酸到磷脂酰乙醇胺的处理显著不同，并且无法通过简单的残基映射和模型比较来揭示，因此需要确定实验X射线结构。

为了实验验证我们的结构模型预测的特征，对psiD基因进行了突变，以用丙氨酸残基单独替换预测的催化活性残基E242，H296和S403。由这些定点诱变剂产生的酶在大肠杆菌中以六组氨酸融合物的形式产生，并通过聚丙烯酰胺凝胶进行分析。

所有三个变体都比野生型对照迁移得更高，表明未切割的酶原。虽然 PsiDE242A结果完全不溶，另外两种变体可溶并通过金属亲和色谱纯化。随后的体外测定显示，PsiDH296A和 PsiDS403A由于未检测到色胺而失去了催化活性。正如模型所预测的那样，这与三合会中涉及的这些残基一致。

我们的研究结果在两个不同的方面为天然产物化学做出了贡献。从生物技术角度和裸盖菇素生产之外，非规范 PSD PsiD 增加了对应用目的有价值的氨基酸脱羧酶库。酶促脱羧已证明其在生物催化合成醇、苯乙烯衍生物、氟联苯取代的抗炎药和各种其他化合物方面的多功能性。

在色胺领域，瘤胃球菌色氨酸脱羧酶被证明可以有效地翻转几种具有极性取代基和替代杂环的 l-Trp 类似物。PsiD 的底物范围扩展了这种方法，并将 4-、5 和 6-甲基取代的 l-Trp 以及苯并[b]噻吩环系统添加到可通过生物催化获得的色胺类似物中。

值得注意的是，非天然的5-甲基裸盖菇素在啮齿动物模型中已被识别为潜在的迷幻剂。结构模型的可用性支持进一步有针对性的工程方法，以提高裸盖菇素或类似物的生物技术生产的催化性能。

从生物合成的角度来看，PsiD的表征证实了其在裸盖菇素生物合成过程中作为第一酶的作用。当蘑菇原木形成过程中生物合成开始时，psiD的395倍上调证实了这一概念。PsiD对l-Trp和一些衍生物的强烈偏好与结构上不相关的PLP依赖性P.ubensis芳香族氨基酸脱羧酶PcncAAAD形成鲜明对比，后者也归因于裸盖菇素生物合成过程中的脱羧步骤。

后一种酶没有编码在裸盖菇素生物合成基因座中，Slot及其同事令人信服地证明了其进化起源和随后作为连续单位跨物种的水平转移。

笔者认为：我们的生化表征证实了PsiD作为裸盖菇素生物合成的网关酶的概念，并有助于简化其生物技术生产策略。未来的工作将包括一组酶原形式的实验结构测定以及具有不可加工靶标的各种复合物，以充分阐明启动裸盖菇素生物合成的酶的机制，裸盖菇素是最具标志性的天然产物之一，并有望作为治疗重度抑郁症的迫切需要药物。

参考文献：