ACS AMI：破解骨再生难题！核壳结构多孔磷酸钙生物陶瓷球闪亮登场

在骨缺损中实现充分的新骨再生是一个巨大的挑战，因为它需要高效的成骨。磷酸钙（CaP）生物陶瓷，包括羟基磷灰石（HA）和双相磷酸钙（BCPs），由于其良好的骨传导性和生物降解性，已被广泛用于临床骨缺损填充。但如何将两者结合并设计出更高效促进骨再生和血管再生能力的材料覆盖不规则骨缺损处是一直在研究的难题，因此开发一种更高效、可覆盖不规则骨缺损创面的新型材料十分关键。

近日，来自四川大学的杨晓、沈彬教授团队制造了核壳结构多孔磷酸钙生物陶瓷球用于增强骨再生。相关研究成果以“Core Shell Structured Porous Calcium Phosphate Bioceramic

Spheres for Enhanced Bone Regeneration” 为题于2022年10月18日发表在《ACS Applied Materials & Interfaces》上。

图1. 核壳生物陶瓷颗粒的制造流程和理化性质。

研究人员通过同轴双喷嘴微流控系统结合海藻酸钙凝胶成型和H2O2发泡技术制造了核心-外壳结构的BCP@HA和HA@BCP生物陶瓷颗粒。镜下可看到干燥前的BCP@HA生物陶瓷颗粒光滑的表面，μ-CT重建证实了生物陶瓷颗粒的多孔结构，孔隙均匀地分布在生物陶瓷颗粒内部。经过干燥和烧结后，颗粒直径减小且具有更坚实和更圆的构造。以上结证明BCP@HA和HA@BCP生物陶瓷颗粒的成功构建。

图2 不同生物陶瓷颗粒的组成和结构特征

通过XRD和FTIR光谱显示四个生物陶瓷颗粒烧结后，所有的衍射峰都与HA和β-TCP标准卡一致。且HA生物陶瓷显示出PO43-在567和603cm-1的峰。此外，BCP@ HA、HA@BCP和BCP生物陶瓷的吸收峰呈现出与β-TCP相似的特征带，包括3571 cm-1的OH-峰、1626 cm-1的吸收峰，以及PO43-在1044、1091、963、602和570 cm-1的相应波长。这些结果和上述XRD分析同以前研究一致。通过光镜、X线、μ-CT观察四种生物陶瓷颗粒的横截面形态，其中黑色钛粉混合在HA相中。在BCP@HA生物陶瓷中，白色的BCP核心被黑色的HA外壳所包围，而在HA@BCP颗粒中则观察到相反的情况。此外，单相HA生物陶瓷都是黑色的，而单相BCP生物陶瓷是纯白色的。根据SEM图显示，不同颗粒的横截面上存在着相互连接的微孔结构。

图3 生物陶瓷颗粒孔隙率和孔径分布

为了评估生物陶瓷颗粒堆积形成的孔隙率，研究人员将生物陶瓷颗粒放在一个2mL的EP管中。显示所有的生物陶瓷颗粒都具有均匀的颗粒大小和密集的生物陶瓷颗粒聚集。μ-CT重建的三维图像，显示生物陶瓷颗粒在管内稳定地排列，并可在缝隙间形成大孔。孔隙率约为70%。对BCP@HA、HA@BCP、HA和BCP散装材料的孔径进行分析显示：孔径分布在100-600μm范围内，在孔径约为150和450μm处有两个相对富集的峰值。

图4. 不同生物陶瓷颗粒在体外的降解情况和磷灰石的形成

为了研究四种生物陶瓷颗粒的降解行为，研究人员对其降解形态、离子释放曲线和重量损失进行了测量。通过SEM观察了不同生物陶瓷颗粒在降解前后的微观形貌。在Tris-HCl缓冲溶液中浸泡7天后，发现四组样品都发生了降解。其中，HA样品的降解速度最慢，HA@BCP和BCP样品降解速度较快。在Tris-HCl和柠檬酸中浸泡1、3和7天后，对离子释放曲线和重量损失进行分析，发现四组颗粒释放的Ca2+和PO43-离子逐渐累积，BCP组的离子浓度明显大于BCP@HA和HA@BCP。对四组重量损失进行排序，其顺序是HA < HA@BCP < BCP@HA < BCP。对生物陶瓷颗粒在SBF中的表面进行SEM分析。发现形态发生了变化，在表面上形成了骨质磷灰石层，表明这四组生物陶瓷都具有良好的诱导体外骨质磷灰石生成的能力。

图5. BMSCs与不同生物陶瓷颗粒共培养的附着力、分布、细胞活力和增殖分析

研究人员对BMSC在不同生物陶瓷颗粒上的迁移和分布进行分析，显示MSCs在颗粒表面持续生长。细胞可以从表面迁移到不同生物陶瓷颗粒的内部孔隙中。在HA@BCP颗粒上有更多的细胞附着。通过活死染色显示所有的生物陶瓷都与共培养细胞具有良好生物相容性。对材料表面附着能力进行分析，与BCP@HA组和HA组相比，HA@BCP组和BCP组的细胞附着发生得更早，这表明颗粒表面的BCP成分比HA成分更容易使细胞扩散。同时CCK-8检测表明，在共培养的第3天和第7天，HA@BCP和BCP组的BMSCs增殖高于BCP@HA和HA组。

图6. 不同生物陶瓷颗粒对BMSCs成骨能力和RAW264.7细胞分化为破骨细胞的影响

为了评估HA@BCP的成骨能力，研究人员表征了核壳生物陶瓷颗粒对BMSCs中关键成骨基因表达的影响。发现HA@BCP组的BMSCs表现出明显的BSP、ALP和Runx2基因表达上调，并且BCP@HA和HA@BCP组的OCN mRNA、OPG mRNA水平高于HA和BCP组。成骨细胞表达的RANKL在单核细胞/巨噬细胞向破骨细胞的终末分化和骨吸收的启动中起着重要作用，研究人员发现BCP@HA和HA@BCP组在3天和7天的共培养后，RANKL mRNA水平低于HA和BCP组，表明有潜在的抗骨细胞生成作用。对不同生物陶瓷颗粒诱导体外破骨细胞生成情况分析，表明与BCP@HA、HA和BCP组相比，HA@BCP生物陶瓷的破骨细胞中Cath-K mRNA水平被明显抑制。对于CAⅡ和c-fos的表达，与BCP@HA组和BCP组相比，HA@BCP组在3天和7天后的抑制效果突出。培养3天后，HA@BCP组的NFATc1 mRNA表达远高于HA组，而在第7天则明显低于BCP@HA和BCP组。对于MMP-9的表达，在共培养3天和7天时，HA@BCP组和HA组的抑制作用比BCP@HA组和BCP组强。这些结果表明，核壳结构可以影响破骨基因转录因子的表达，从而改变下游的相关基因。

图7. 植入不同生物陶瓷颗粒后的动物运动功能评价和血清标志物分析

使用大鼠股骨临界性缺损模型评估了BCP@HA、HA@BCP、HA和BCP生物陶瓷颗粒的成骨能力，并对术后动物运动功能行为和血清生物标志物水平进行了体内评估，研究显示BCP@HA组的步幅恢复明显好于HA和BCP组。对骨转换标志物分析，与BCP@HA组相比，HA@BCP的TRAP水平明显较低。然而，BCP@HA和HA@BCP组的骨形成标志物PINP的血清水平高于纯成分组。BCP@HA组和HA@BCP组的PINP浓度在第8周和第12周也分别显示出明显的差异。以上结果表明BCP@HA生物陶瓷球具有更优异的体内成骨能力。

图8. 评估不同生物陶瓷颗粒的体内骨再生能力

为了评估不同组体内骨再生能力，研究人员进行了生物陶瓷颗粒植入物的嵌顿骨分析。在第8周和第12周，对各组有代表性的股骨骺线的冠状切片进行了重建。结果显示与植入后第8周相比，所有组的生物陶瓷颗粒在12周后都有部分降解，在HA@BCP组有更多新骨形成。HA@BCP组的植入物与宿主骨有良好的骨结合，表明BCP外壳具有良好的骨传导性。对三维μ-CT重建干骺端骨中的横截面图像，以及植入的生物陶瓷颗粒一侧的骨组织进行分析。同样显示HA@BCP组在股骨远端缺损区域内表现出更多的新骨形成以及出现的植入生物陶瓷孔的新骨。以上结果再次从体内角度证明了HA@BCP生物陶瓷球具有更优异的新骨生成能力、良好的骨传导能力。

图9. 不同生物陶瓷颗粒修复的缺陷的血管造影和组织学分析

研究人员对骨再生区域的血管再生情况进行了分析，结果表明，在股骨缺损区的微血管成功注入了造影剂后。HA@BCP组在缺损区的血管化程度最高，血液供应丰富，其次是BCP@HA组。对血管体积分数进行了量化发现，HA@BCP组的血管体积分数明显高于HA和BCP组。

在植入12周后，对组织进行HE染色分析显示：BCP@HA组的新骨组织最初是在BCP核心层形成的。相反，HA@BCP组的新骨组织从材料表面延伸到内部，并逐渐取代内部的HA核心。Masson染色也证实HA@BCP组有更成熟的骨组织形成，说明HA@BCP生物陶瓷颗粒可更有效地促进骨基质胶原的合成和成熟。

总之，该研究评估了两种核壳结构生物陶瓷颗粒--BCP@HA和HA@BCP的体外和体内成骨性能，并与单相的HA和BCP颗粒进行了比较。结果表明了所有的生物陶瓷颗粒在与BMSCs和破骨细胞分化的混合培养时表现出良好的生物相容性。在HA@BCP中BMSC的增殖和成骨活性更为明显，而破骨细胞的生成在HA@BCP组中被优先抑制。体内实验也表明， HA@BCP组的骨形成能力与血管新生能力较强，HA@BCP组的新骨组织从材料表面向内生长；相反，BCP@HA组更倾向于先在核心层形成骨组织。综上所述，核壳结构的HA@BCP颗粒具有优越的成骨能力，可以成为治疗大面积骨缺损的高性能骨空隙填充剂。

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.2c15614

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