《Small》: 在多功能微流体混合装置中一步形成靶向脂质体

由于靶向脂质体增强了靶位点的细胞摄取和有效载荷积累，是一种很有前途的载体，在COVID-19疫苗、分子成像和癌症治疗中受到了极大的关。然而，传统靶向脂质体制备的方法仍存在操作复杂、耗时长、重现性差等局限性。基于此，2022年11月30日，中南大学的陈泽宇、陈翔、赵爽教授及其团队在《Small》杂志发表题为“One-Step Formation of Targeted Liposomes in a Versatile Microfluidic Mixing Device”的研究论文，提出了一种使用多功能微流体混合装置(MMD)一步构建靶向脂质体的简单且可扩展的策略。该设计为多功能脂质体的合成提供了先进的合成平台，具有较高的生产速率和可控性。（图1）

图1. 微流体混合器的组合方案

1. MMD的制作

本研究设计了一个3D打印的MMD，具有开放通道，易于制作和清洁。大多数微流控器件需要透明体来观察流动分布，因此本研究选择了一种含有(甲基)丙烯酸酯单体、(甲基)丙烯酸酯低聚物和光引发剂的树脂，鉴于其优异的透明度。该树脂具有3.8 GPa的弹性模量，在高压条件下可防止弹性变形。MMD被设计成具有FFM、SSHM和TM。FFM已广泛应用于微流体介导的脂质体制备中，交错人字型混合器(SHM)被认为是一种有效的流混合策略，使用SSHM连接到FFM以实现更好的混合性能。利用TM将靶向配体修饰至脂质体表面。图2显示了FFM、SSHM和TM的详细设计参数。（图2）

图2. MMD的制作

1. Apt-ICG@Lip的制备和表征

研究者使用MMD一步合成了靶向纳米脂质体。FFM包含两股水溶液和一股有机溶液。在微流控合成过程中，脂类和ICG的配方被溶解在有机相中。然后，将这些液体引入FFM以形成含有ICG的脂质体(ICG@Lip)。该研究使用微流控辅助方法能够一步形成靶向脂质体纳米平台。接下来进一步将制备的apt-ICG@Lip进行表征，并验证其在分子成像和癌症治疗中的靶向性和治疗效果。（图3）

图3. 一步形成Apt-ICG@Lip

与传统的原料法相比，微流体介导法具有囊泡尺寸分布小、重复性高的特点。在这项工作中，ICG@Lip是在一系列低FRR下制备的，以解决FRR、脂质浓度和粒度分布之间的权衡关系。通过改变FRR，得到不同平均直径的脂质体。利用动态光散射(DLS)、紫外可见分光光度计、透射电子显微镜(TEM)等表征其理化性质。用CCK-8法测定其干预A549细胞后的细胞活力。上述结果表明，Apt-ICG@Lip具有较低的细胞毒性，适合于生物医学应用。（图4）

图4. 在一系列低FRR条件下制备 ICG@Lip

三、活体PA和荧光成像

ICG是FDA批准的用于PA和荧光成像的外源性造影剂。然而，游离ICG因为其血液停留时间短，穿透生物屏障的能力差，体内PA成像仍然是一项具有挑战性的任务。为了解决这些限制，ICG与纳米载体(如脂质体)的结合在生物医学成像应用中获得了越来越多的研究。该研究将一步微流控方法应用到了制备Apt-ICG@Lip上，并且验证了Apt-ICG@Lip在PA和荧光成像中的靶向和成像能力。有趣的是，与ICG@Lip相比，Apt-ICG@Lip表现出更强的肿瘤靶向效率，说明Apt-ICG@Lip具有较高的特异性识别能力。此外，由于适体的特殊性(如更高的肿瘤穿透和保留能力、更快的组织吸收能力)，Apt-ICG@Lip表现出了 出色的肿瘤吸收和保留性能。与ICG@Lip相比，Apt-ICG@Lip在肿瘤部位的保留时间更长。上述结果表明，本方法制备的Apt-ICG@Lip与PD-L1过表达癌细胞具有稳定的特异性相互作用，并能更有效地在肿瘤组织中积累。（图5）

图5. 体内PA和荧光成像研究

1. PTT效能

PTT是一种很有前途的治疗癌症的方法。光热剂可从适当波长的光源吸收能量，并产生局部热，可诱导细胞凋亡和激活免疫反应。ICG作为FDA批准的染料，由于其优异的光治疗能力，被广泛应用于PTT研究。本研究进一步调查了Apt-ICG@ Lip的PTT效能。研究表明，AptICG@Lip可以有效地积累在表达PD-L1的肿瘤区域，且PTT效应增强。流式结果显示，与ICG@Lip组相比，Apt-ICG@Lip组LLC细胞的晚期凋亡比例更高，表明Apt-ICG@Lip组的PTT效率提高。体内PTT显示，与其他组相比，Apt-ICG@Lip组的温度最高，对肿瘤组织具有突出的特异性和亲和力。免疫组化也显示，经Apt-ICG@Lip +激光治疗的肿瘤其Ki67和S100B表达明显下降。免疫荧光显示，肿瘤部位CD3+和CD8+ T细胞正常浸润。上述结果表明，Apt-ICG@Lip由于其主动靶向能力，具有更好的光治疗效果，进一步证明了该一步法形成的靶向脂质体具有更好的疗效。（图6）

图6. 体外和体内PTT研究

1. MMD的多功能性

为了验证该方法的多功能性，进一步用MMD制备了各种不同用途的靶向脂质体。该材料适用于脂溶性和水溶性药物的包封，在生物医学领域具有很大的应用潜力。除ICG外，还选择了异硫氰酸荧光素(FITC)、NHWD-870和亚甲基蓝(MB)作为模型药物。用上述方法制备了PD-L1靶向适配体或抗Her2抗体功能化的脂质体构建（图7）。结果表明，该研究的MMD可以一步形成不同类型的靶向脂质体。

图7. 不同条件处理的细胞的CLSM图像

该工作提供了一个一步合成靶向纳米颗粒的多功能平台，在靶向给药系统(如分子成像、癌症治疗等)中具有巨大潜力。

全文连接: https://doi.org/10.1002/smll.202205498