长片段PCR扩不出来怎么办？

普通的PCR只能扩增到3-4kb的DNA片段，但是很难扩增出来5kb以上的长片段基因，使PCR技术受到了很大限制。

造成普通PCR扩增长片段限制的因素及一些解决方法有以下几点：

1.普通PCR反应中应用的Taq聚合酶就具有较高频率的错误碱基掺入，不能有效扩增长片段DNA。应该使用一些错配率更低的耐热聚合酶。

2.高温PCR条件下的缓冲液可能会失去缓冲能力，造成模板DNA和产物DNA的损坏，会增加非特异性扩增以及二聚体的出现。这时应该使用缓冲能力较强的缓冲液，保证缓冲液的PH值稳定不影响酶的活性；或者可以改变PCR反应程序中的温度，保证酶活性来促使长片段。

3.DNA模板质量问题，没有提取到含有足够量目的基因的完整模板，如发生这种情况应该提取新鲜的样本或者对核酸提取使用比较温和的方法来降低提取过程中的损伤情况。

4.本身基因型具有差异性的样本导致扩增失败，设计有缺陷的引物，会出现二聚体、非特异性扩增甚至扩增失败，可以选择设计相对保守的引物。

5.较长的模板结构也相对较高级，复杂模板结构，如高GC含量等，DNA聚合酶难以与模板结合，可考虑添加适量DMSO等帮助扩增顺利进行。

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