香砂六君子汤合除痰解毒中药对Lewis肺癌小鼠免疫逃逸的影响
组别 | 剂量/g·kg-1 | 肿瘤质量/g | 肿瘤体积/mm3 | 抑瘤率（%） |
模型组 | 1.23 0.66 | 1438.53 64.94 | ||
顺铂组 | 5.0 | 0.70 0.20 | 711.40 176.592） | 50.55 |
香砂六君子汤低剂量组 | 17.88 | 1.24 0.90 | 1028.05 280.951) | 28.53 |
香砂六君子汤中剂量组 | 35.75 | 0.84 0.32 | 800.86 409.561) | 44.33 |
香砂六君子汤高剂量组 | 71.50 | 1.03 0.52 | 1122.66 236.561) | 21.96 |
联合组 | 5.0+35.75 | 0.49 0.111) | 463.67 144.042） | 67.77 |
模型组肿瘤细胞排列紧密，少见坏死及空泡，胞核异型、核质比高，核仁明显，多见病理性核分裂相；顺铂组局部坏死伴轻度出血，可见少量坏死细胞碎片；香砂六君子汤低、中、高剂量组肿瘤组织呈不同程度的坏死伴出血，中剂量组坏死最明显，多见无结构的嗜酸性物；联合组细胞排列松散，数量减少，少见病理性核分裂相，多见坏死的细胞碎片及空泡，多见红细胞。
与模型组比较，顺铂组、香砂六君子汤中剂量组、联合组RAE-1、NKG2D mRNA升高，差异有统计学意义（P<0.05、P<0.01），中剂量组、联合组IFN-γ mRNA升高（P<0.05、P<0.01）。
与顺铂组比较，联合组NKG2D mRNA明显升高（P<0.01）。
组别 | 剂量/g·kg-1 | RAE-1 | NKG2D | IFN-γ |
顺铂组 | 5.0 | 2.56 0.281） | 2.31 0.131） | 2.19 0.36 |
香砂六君子汤低剂量组 | 17.88 | 1.90 0.34 | 0.80 0.09 | 0.54 0.07 |
香砂六君子汤中剂量组 | 35.75 | 3.01 0.492） | 2.95 0.372） | 2.89 0.551） |
香砂六君子汤高剂量组 | 71.50 | 2.17 0.50 | 1.74 0.36 | 1.86 0.34 |
联合组 | 5.0+35.75 | 3.48 0.862） | 4.45 0.742）3） | 3.65 1.142） |
采用阳性细胞面积占比对蛋白进行定量分析。
与模型组比较，顺铂组、中药中、高剂量组及联合组RAE-1蛋白表达均升高，且具有统计学意义（P<0.05，P<0.01），阳性着色面积增多；各用药组NKG2D、IFN-γ蛋白均明显升高（P<0.01）。
与顺铂组比较，中药中、高剂量组、联合组NKG2D、IFN-γ阳性着色面积均增多，蛋白表达不同程度升高（P<0.05，P<0.01）。
组别 | 剂量/g·kg-1 | RAE-1 | NKG2D | IFN-γ |
模型组 | 0.03 0.01 | 0.05 0.01 | 0.05 0.00 | |
顺铂组 | 5.0 | 0.14 0.021） | 0.11 0.012） | 0.12 0.002） |
香砂六君子汤低剂量组 | 17.88 | 0.02 0.00 | 0.10 0.022） | 0.08 0.012） |
香砂六君子汤中剂量组 | 35.75 | 0.18 0.012） | 0.17 0.012）4） | 0.20 0.012）4） |
香砂六君子汤高剂量组 | 71.50 | 0.12 0.021） | 0.14 0.012）3） | 0.15 0.002）4） |
联合组 | 5.0+35.75 | 0.20 0.072） | 0.20 0.012）4） | 0.24 0.002）4） |
与模型组相比，各用药组RAE-1、NKG2D、IFN-γ蛋白表达均增加，其中香砂六君子汤中剂量组及联合组RAE-1、NKG2D蛋白表达差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01），中药低、中、高剂量组及联合组IFN-γ蛋白均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；与顺铂组比较，联合组RAE-1、IFN-γ蛋白表达均上升（P<0.05，P<0.01），香砂六君子汤中剂量组和联合组NKG2D蛋白表达升高（P<0.05，P<0.01）。
与模型组比较，各用药组p-JAK2蛋白表达均下降，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），中药中、高剂量组及联合组p-STAT3、p-JAK2/JAK2蛋白表达下降（P<0.05，P<0.01），中药中剂量组和联合组p-STAT3/STAT3蛋白表达下降（P<0.05，P<0.01），其余通路蛋白IL-6、 STAT3无明显改变；与顺铂组比较，中药低、中剂量组及联合组p-JAK2蛋白均下降（P<0.05，P<0.01），联合组p-STAT3蛋白表达下降（P<0.05），中药中剂量组、联合组p-JAK2/JAK2蛋白表达明显下降（P<0.01），联合组p-STAT3/STAT3蛋白表达下降（P<0.05）。
组别 | 剂量/g·kg-1 | RAE-1/GAPDH | NKG2D/GAPDH | IFN-γ/GAPDH |
模型组 | 0.26 0.10 | 0.08 0.01 | 0.37 0.17 | |
顺铂组 | 5.0 | 0.48 0.12 | 0.43 0.15 | 0.59 0.02 |
香砂六君子汤低剂量组 | 17.88 | 0.75 0.23 | 0.32 0.05 | 0.80 0.201) |
香砂六君子汤中剂量组 | 35.75 | 0.89 0.221) | 0.66 0.051)3) | 0.92 0.112) |
香砂六君子汤高剂量组 | 71.50 | 0.66 0.18 | 0.28 0.03 | 0.74 0.121) |
联合组 | 5.0+35.75 | 1.10 0.112)3) | 0.97 0.092)4) | 1.14 0.082)4) |
组别 | 剂量/g·kg-1 | IL-6/GAPDH | JAK2/GAPDH | p-JAK2/GAPDH | STAT3/GAPDH | p-STAT3/GAPDH | p-JAK2/JAK2 | p-STAT3/STAT3 |
模型组 | 0.67 0.16 | 1.02 0.06 | 1.10 0.06 | 1.04 0.13 | 1.13 0.06 | 1.08 0.06 | 1.21 0.06 | |
顺铂组 | 5.0 | 0.86 0.15 | 0.74 0.082) | 0.73 0.032) | 0.90 0.28 | 0.79 0.21 | 0.99 0.04 | 1.03 0.28 |
香砂六君子汤低剂量组 | 17.88 | 0.85 0.28 | 0.94 0.073) | 0.93 0.051)4) | 0.81 0.28 | 1.05 0.14 | 0.99 0.05 | 1.23 0.17 |
香砂六君子汤中剂量组 | 35.75 | 0.75 0.05 | 0.81 0.061) | 0.57 0.062)3) | 0.79 0.15 | 0.69 0.091) | 0.70 0.072)4) | 0.77 0.111) |
香砂六君子汤高剂量组 | 71.50 | 0.71 0.10 | 0.75 0.012) | 0.63 0.042) | 0.75 0.18 | 0.75 0.061) | 0.83 0.052) | 0.95 0.07 |
联合组 | 5.0+35.75 | 0.70 0.22 | 0.86 0.04 | 0.26 0.052)4) | 0.72 0.17 | 0.40 0.042)3) | 0.30 0.062)4) | 0.51 0.052)3) |
与模型组比较，小鼠脾脏组织中，各用药组RAE-1、NKG2D蛋白均明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。
与顺铂组比较，香砂六君子汤中剂量组、联合组RAE-1蛋白表达显著增高（P<0.01），中、高剂量组和联合组NKG2D蛋白表达明显升高（P<0.01）。
组别 | 剂量/g·kg-1 | RAE-1/GAPDH | NKG2D/GAPDH |
模型组 | 0.19 0.06 | 0.25 0.05 | |
顺铂组 | 5.0 | 0.73 0.062) | 0.56 0.052) |
香砂六君子汤低剂量组 | 17.88 | 0.91 0.052) | 0.74 0.072) |
香砂六君子汤中剂量组 | 35.75 | 1.10 0.012)4) | 1.01 0.052)4) |
香砂六君子汤高剂量组 | 71.50 | 0.97 0.182) | 0.91 0.052)4) |
联合组 | 5.0+35.75 | 1.39 0.052)4) | 1.28 0.082)4) |
免疫逃逸是肿瘤治疗过程中继续发展的主要原因之一，肿瘤细胞脱离机体免疫监视后生物学进程加快，进一步导致肿瘤增殖、侵袭和转移。
《黄帝内经》曰“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”，恶性肿瘤在正气不足的基础上，邪气旺盛所致，故治疗原则以扶正祛邪为主。
中医药是我国传统医学，运用多种治疗方式（扶正培本、软坚散结等）均能提高机体免疫功能，达到抵抗外邪的作用。
重庆医科大学附属第一医院李荣亨教授治疗肺癌的理念与之契合，其认为肺癌是在正气虚损的前提下，瘀邪、痰邪积聚成瘤，因此在香砂六君子汤的基础上加用威灵仙、仙鹤草散结消癥、除痰解毒，三棱、莪术活血化瘀而成经验方（组成为：党参30g，木香15g， 法半夏10g，砂仁15g， 莪术30g，白术15g， 仙鹤草30g，陈皮10g，三棱30g，威灵仙30g， 茯苓30g，黄芪30g）。
魏丽群等的研究表明，加味四君子汤能通过提高胸腺质量、脾脏内CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞比例抑制肺癌Lewis细胞增殖。
本研究结果显示，香砂六君子汤加减能够减小Lewis肺癌瘤体的质量和体积，有效抑制Lewis肺癌的进展。
NKG2D为NK细胞表面受体，RAE-1为其主要配体之一。
活化后的 NK 细胞可通过分泌效应分子如α肿瘤坏死因子（TNF-α）、IFN-γ等发挥抗肿瘤作用。
HOSSEINZADEH等研究发现，肝癌患者组织中MHCⅠ类多肽相关序列A（MICA）表达降低，导致NK细胞对肿瘤敏感性下降，引起免疫逃逸。
在高表达NKG2DL的小鼠细胞系中，NK细胞以NKG2D依赖性方式被激活，肿瘤的进展被显著抑制。
JEGANATHAN等的研究证实高表达RAE-1的肺癌小鼠存活率增加。
本研究结果显示，香砂六君子汤加减干预后，RAE-1、NKG2D基因及蛋白水平均升高，下游效应分子IFN-γ增加，其中中剂量组效果最为明显，表明香砂六君子汤加减可通过NKG2D/NKG2DL轴活化NK细胞，发挥抗肿瘤作用，促进NK细胞活化可能为Lewis肺癌免疫治疗提供新方案，这与前期网药分析结果相吻合。
在本实验中，模型组脾脏组织中RAE-1、NKG2D蛋白表达水平低，顺铂组升高，但升高程度不及香砂六君子汤加减各剂量组，这与前期研究证实铂类化疗药物可降低机体免疫一致。
铂类化疗药发挥抗肿瘤活性的机制之一是通过免疫介导，促进肿瘤细胞的抗原呈递作用，这也是近年来免疫治疗和化疗药物联合应用的理论支撑。
本研究也证实了这一点，顺铂与香砂六君子汤加减联用后，对机体的免疫抑制作用得到逆转。
提示香砂六君子汤加减与化疗药物联用能起到协同增效作用，抑制Lewis肺癌免疫逃逸。
IL-6/JAK/STAT3通路的激活参与肿瘤的发生、发展多个环节，且参与肿瘤免疫逃逸，被认为是肿瘤进展中的关键通路。
IL-6是IL-6家族细胞因子的原始成员，在树突状细胞（DC）中，IL-6高表达可促进免疫逃逸，抑制细胞免疫功能。
其与IL-6受体（IL-6R）结合后依靠自身结构上的信号转导受体β亚基膜糖蛋白130（gp130），gp130作为同型二聚体以触发信号通路。
下游蛋白激酶（JAK）家族被激活并磷酸化其尾部的酪氨酸残基。
这些磷酸化作为信号传导与转录激活因子（STAT）的对接位点，并通过其SH2结构域与之结合。
因此，STATs被JAK激活并转移到细胞核以调节基因表达，与JAK共同参与免疫逃逸，促进肿瘤生长、转移。
在JAK/STAT众多亚型中，JAK2/STAT3占主要地位。
STAT3的过度激活也被证实能够增强肿瘤免疫逃逸。
IL-6表达升高可刺激p-JAK2和p-STAT3的上调，并且促进肺腺癌A549细胞获得干性特征。
不同的是，在本研究中，与模型组比较，各用药组IL-6蛋白水平无明显差异，p-JAK2、p-STAT3均下调，表明在本模型中，香砂六君子汤加减可调控JAK2/STAT3通路，而IL-6可能不在上游激活JAK2、STAT3信号转导。
在一项关于去势抵抗性前列腺癌的研究中，与对照组相比，在添加JAK/STAT抑制剂的细胞系中，NKG2DLs（ULBP1、ULBP2、ULBP3、MICA、MICB）均明显升高。
此外，在OKITA等的实验中，也发现通过运用JAK-STAT抑制剂托法替尼，能够阻断NSCLC患者中NKG2DL的下调。
以上研究均提示JAK-STAT抑制剂可能是一种靶向NKG2DL的有前景的免疫治疗策略。
在本实验中，香砂六君子汤加减抑制JAK2/STAT3通路的同时，我们观察到RAE-1、NKG2D的上调，证实香砂六君子汤加减可通过NKG2D/NKG2DL路径激活NK细胞活性，抑制肿瘤免疫逃逸，控制肿瘤生长。
本研究在动物实验层面证明了香砂六君子汤合除痰解毒中药具有治疗肺癌的潜力，缺乏多层面验证，接下来可进一步探究其在细胞层面是否具有同样效果，同时，可进一步完善网络药理学、质谱分析等明确具体活性成分和作用靶点蛋白，为中医药参与肿瘤免疫治疗提供依据。
页面更新：2024-04-03
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