通过强氧化剂处理异种骨抗原来观察异种骨块的病理反应

煅烧、化学试剂浸渍等理化手段是处理异种骨抗原的常用方法，采用H2O2等强氧化剂处理异种骨抗原工艺简单，效果可靠，因而被广泛应用。本研究将新鲜牛松质骨分别制备成30*20*15mm的块状，经系列脱脂、H2O2浸渍及部分脱钙处理、成为去抗原异种骨块型载体(an tigen-extracte dmas.S.Lve.bovine can cellous bone carrier,MBC)，并移植到动物体内，采用淋巴细胞体外二次刺激增殖实验、酶联免疫吸附实验及组织学观察，研究移植后动物体内的细胞免疫、体液免疫反应及受体动物对MBC的局部病理反应，为异种骨移植的广泛应用奠定基础。

取材时将植人物及周围肌肉组织一并取出，10%中胜甲醛液固定，脱钙，石蜡包埋，0.5um连续切片，H.E.染色，光镜下观察受体动物局部组织对各植人物的反应。

FB组，植入5d时BALB小鼠体内即有特异性抗体血清产生;OD值于植入10d时明显升高;20d达峰值为强阳性;30d时OD值略有下降，但仍较高。5，10，20，30d四个时间点之间抗体水平的变化明显，相差显著(P<0.01),10，20，30d时FB组OD值均明显高于MBC72，GBC48组(P<0.01);20，30d的FB组OD值高于MBC48组(P<0.05),MBC48组，植人5，10d时抗体血清升高，20d达高峰为阳性，OD值高于MBC72，GBC48组(P<0.05)。MBC72,GBC48组，植人5,10d时均未检测出特异性抗体水平的变化，20d其OD略有升高，但均未达到阴性对照血清OD值的2.1倍，为阴性;30d时，二组特异性抗体水平已下降，在各时间点二组OD值相差不显著(P>0.05)。

在论及异种骨移植等相关问题时，首先提出的是免疫排斥反应。由于种属差异的存在，使得异种间骨移植术后必然导致受体动物产生剧烈的排斥反应，因此去除异种骨中主要抗原成分是异种骨移植研究中的首要任务。本实验采用系列脱脂、H2O2浸渍及部分脱钙等处理，获得仅含有骨矿及胶原基质的异种骨载体。通过体外二次淋巴细胞刺激增殖实验及酶联免疫吸附实验，综合评价不同H2O2处理时间的MBC在植入体内后产生的免疫反应。

本研究结果显示，FB植人后5d即可检测到特异性抗体产生，10d抗体水平进一步升高成为阳性，20d达高峰，又成为强阳性，30d抗体水平已有下降，但仍维持较高水平为阳性。将FB经过系列处理，去除各种细胞等有形成分，仅留下部分骨基质蛋白及矿物质成分制成MBC72，GBC48，将其植人BALB/c小鼠体内，小鼠体内仅产生较低水平的特异性抗体血清。淋巴细胞体外刺激增殖实验也表明，在植人后5，10，20，30d，植MBC72，GBC48的S.I.始终接近于1，说明无明显的淋巴细胞刺激增殖作用。

而植人FB组，其S.I.值显著升高，远大于植MBC72，GBC48组，表明FB具有强烈的免疫原性，植人体内后刺激机体免疫系统，引起明显的细胞免疫反应，尤以植人后10，20d最为明显，这与机体细胞免疫反应的时相相吻合。植MBC48组，其S.I.值在各时间点虽然低于FB但仍高于MBC72,GBC48组、表现出一定的淋巴细胞刺激增殖作用，其特异性抗体水平也高于植MBC72，GBC48组，表明经过系列脱脂及30%H2O2,浸渍48h处理可降低其抗原性，但仍未达到完全清除的目的，在体内仍能引起一定的免疫反应。骨基质的主要成分是I型胶原和骨矿。

原胶原分子中不含有色氨酸残基，酪氨酸残基也很少，因此，原胶原的分子抗原性较差。已知的抗原决定簇主要存在于a一肤链的梭基端(C端)，近年来也发现氨基端困端)也含有一定抗原决定簇而导致抗体形成。异种胶原能刺激受体动物产生抗体、但抗体的产生与移植排斥反应并无明确的肯定关系，Frank等认为此对成骨过程无影响，仅为一种副现象。非胶原性骨基质成分在特定条件下也能引起受体动物产生抗体，抗体对成骨的影响同样存在两种相反的结论。

在移植物排斥反应中，T细胞介导的免疫反应发挥着主要的作用。体外二次淋巴细胞刺激增殖效应是检测机体细胞免疫反应水平较为敏感和特异的方法之一。经过系列的脱脂、部分脱蛋白处理，可基本消除异种骨的细胞及血浆成分等抗原性物质，在体外未引起明显的淋巴细胞增殖效应，在体内，受体动物结缔组织容易长人骨小梁间隙，淋巴细胞浸润少，显示出良好的组织相容性。但经上述处理后的牛松质骨不具备骨诱导能力，植人后组织中未能看到新生骨、软胃的形成，在体内仅能起骨传导的作用。由于牛松质骨的天然孔隙结构，将MBC72,GBC48与各种具有诱导成骨能力的物质结合，形成活性骨修复材料将是进一步研究的内容。

去除异种骨的移植抗原物质是保证异种骨移植成功的前提，然而，各种去除抗原物质的方法均不同程度地改变了异种骨的成分、微结构及力学特性，这是一个无法回避的矛盾。H2O2具有良好的消除抗原性的能力，但同时它也对异种骨的强度有一定的损害。为了研究异种松质骨载体制备过程中，H2O2对骨块强度、弹性模量的改变，本实验采用材料力学实验方法初步研究了去抗原处理时限与异种骨有关力学性质改变的相关性，为合理处理异种骨移植材料提供实验依据。

将骨块纵向立于材料万能实验机加载平台上，保持骨块长轴(即骨小梁排列方向)与加载平台垂直，骨块上下平面与加载平台平行。对骨块施加垂直压缩力，横梁移动速度为1mm/s，载荷测量精度为1N，引伸计感应骨块纵向变形，变形测量精度为0.005mm，函数记录仪记录载荷一变形曲线，记录最大破坏载荷9max，计算骨块的强度极限及弹性模量。检测时用生理盐水保持试样湿润。

受载后XY函数记录仪描记出骨块载荷一变形曲线，随着载荷的增加骨块高度被压缩，在曲线的初始段载荷一变形曲线呈现短暂的线性关系，但弹性区范围较小，随着载荷继续增加，变形呈非线性改变，并形成第一个波峰，即载荷变化不大而变形增加明显。此时观察骨块有部分r胃小梁开始骨折、被压缩.此后，变形随载荷的增加而变大，即而形成持续时间更长的第二个波峰，更多的骨小梁断裂、被压缩，骨块高度明显降低，最后骨块整体破坏。

数据经方差分析统计处理后发现:经30%H2O2处理后骨块的抗压强度均遭到显著的破坏，随着处理时间的延长其损坏程度加重，处理后各组的强度均明显低于未处理组(P<0.01)。处理24h后其强度较未处理组降低43.7%;处理48h后降低82.8%;处理72h后降低86.4%;处理96h降低92.8%。处理96h组其强度明显低于各组(P<0.01/0.05);处理72h组与处理48h组相差不显著(P>0.05),但显著低于未处理组及处理24h组(P<0.01)。

各组骨块弹性模量值经方差分析方法处理，经300uH20,处理后骨块的弹性模量发生明显改变。处理72h及96h组弹性模量显著低于未处理组(P<0.01)及24h和48h组(P<0.05)。处理24h、48h组弹性模量亦有低于未处理组的现象，但因限于样本数量较少，未见其有显著性差异(P>0.05)。

一般认为骨骼的韧性取决于胶原，坚硬决定于钙磷，两者结合构成骨骼的生物力学特征。松质骨由骨小梁构成，骨小梁间充满大量的造血细胞及脂肪等组织，松质骨的力学性质除取决于上述二个因素外，还受骨块孔隙密度和骨小梁排列方向的影响。骨块孔隙率越小、密度越大，其抗压强度越大。骨骼无论从形态上，还是从力学性质上看都是不均匀的，具有各向异性的特征,以适应其功能需要。

骨小梁有序沿着运动所引起的骨的主应变方向排列，因此，沿骨小梁排列方向加载，松质骨的承载能力最强。本实验中所选松质骨骨块试样均取自牛胧骨上端骨端，使取材骨块的表观密度基本接近，并且骨块试样的长轴与其骨小梁排列方向相同，实验沿骨块长轴加载，尽量消除试样孔隙率及骨小梁排列方向对实验结果的影响。

Bran比较了几种常用生物性骨移植材料的压缩力学性能，研究表明新鲜冷冻人松质骨的平均破坏载荷为863N(样品来自美国Os Bone)和3492N(Mid American Tissue Center)，冻干松质骨为1595N(American Red Cross)，空气干燥、乙烯氧化物消毒松质骨分别为1338N(Os Bone)和1616N(Mid American),牛松质骨破坏载荷为2967N(Unilab)。

Poumarat等采用破坏性压缩试验比较了新鲜人、牛松质骨及高度纯化处理的异种骨T650，发现三种骨材的应力一应变曲线基本相似，T650受其骨小梁密度的影响较大，高密度T650强度极限为9.6MPa，与新鲜牛松质骨的8.5MPa相似，而中密度者仅为5.9MPa，明显降低。本文在保证骨块试样表观密度基本相同的条件下，检测H2O2对牛松质骨抗压强度、弹性模量的影响。

实验结果发现，未经H2O2,处理的牛松质骨块其强度为9.5174MPa，与Poumarat等报道大致相同，但经H2O2处理后，其强度明显降低，处理24h降低43.7%为5.3564MPa，处理96h时竟降低92.8%，仅为0.6896MPa，经曲线拟合的统计学分析发现H2O2处理时间对骨块强度的影响呈指数曲线关系。H2O2同样也改变了骨块的弹性模量，随着H2O2处理时间的延长，骨块弹性模量有减小的趋势，表明骨块经处理后，发生弹性变形的能力较差，表现出脆性增加。

实验结果表明，随着H2O2处理时间的增加，其力学强度降低，脆性增加，因此，在处理异种骨块时，必须在保证异种骨抗原成分有效去除的前提下尽量缩短处理时间，以便最大限度地保留骨块的力学特性。结合移植免疫的基础研究结果，H2O2处理块状异种松质骨的最佳时间可为72h。

与皮质骨相比，松质骨的最大特点是其疏松的网状孔隙结构，在临床应用中，松质骨一般只用于骨缺损的充填，对于是否能修复长骨节段性缺损一直存在着争论。松质骨抗压强度差，在长骨节段性骨缺损环境中容易被压缩、破坏，但也有人提出松质骨可修复长骨2厘米内的节段性缺损。从植人物的最终转归上看，无论是皮质骨还是松质骨最终将被自体新生骨所替代，新生骨进一步塑形、改建、机械强度逐渐增加以适应功能需要。

因此植人物的初始强度不应该成为限制松质骨在修复长骨骨缺损中应用的主要因素，在内、外固定器的有效辅助下，使骨缺损植骨区域一段时间内保持稳定，将松质骨作为暂时性支架植入，可能会有广泛应用的前景。

参考文献：

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