引言

浮霉菌门类（Plan ctomycetes）细菌具有独特的细胞结构和严重内陷的膜，其中不动杆菌（T. Immobilis）的亚细胞蛋白质组通过差异溶解和随后的 LC-MS/MS（液相色谱串联质谱）分析进行检查，共鉴定出 1569种蛋白质。

Tris（三（羟甲基）氨基甲烷）可溶性组分主要含有细胞质蛋白，而内膜蛋白和外膜蛋白分别存在于Triton X-100（去污剂） 和SDS（十二烷基硫酸钠）可溶性组分中，但对比大肠杆菌的亚细胞蛋白质组，在SDS可溶性部分中预测的细胞质蛋白数量高出五倍。

本文将分析并预测位于细胞质中的蛋白质的表达模式，与T. immobilis的内膜和外膜的差异关系，使用基于差异蛋白质溶解度的亚细胞分级分离方案，以期发现其生物特性发生了独特变化或不同的亚细胞位置。

一、使用FIB-SEM进行的3D重建揭示T.immobilis 中连续而严重内陷的膜网络

基于FIB-SEM（聚焦离子束扫描电子显微镜）分析重建了T. immobilis的三维 (3D)模型，细胞被部分重建，重建的细胞显示存在由细胞质膜内陷形成的隧道系统，它将非区室化的细胞质空间与扩大的周质空间分开。

相似体积里其他几个目视检查的细胞中也观察到了这种细胞结构，不动杆菌细胞质空间中具有明显封闭结构的细胞，显示出明显的膜损伤迹象、细胞内碎片、破裂的膜囊泡和低对比度的周质空间，这种看似受损的细胞不被认为代表健康和完整细胞的细胞计划。

G. obscuriglobus（暗球藻细菌）中的类核通过FIB-SEM和其他电子显微镜技术更加浓缩及明显，故此可以重建，类核似乎由一个 DNA 复合物组成，而内陷的膜和浓缩的类核同时存在于一对出芽细胞的母细胞和子细胞中，该细胞对是在出芽后期捕获的。

但这仅在后期阶段才观察到，正如之前一项使用低温电子断层扫描的研究一样，我们在几乎每个细胞中都观察到一个直径高达 400 nm 的单一球形颗粒，在重建的和另一个目视检查的出芽细胞中，该颗粒仅存在于母细胞中。

为了确定细胞的细胞质和膜部分的蛋白质含量，在实验室中培养了大量不动杆菌，直到细菌细胞达到早期稳定期，生成时间估计为g = 8 小时，大肠杆菌K12 MG1655作为对照包括在内，同样培养至早期稳定期。

用超声处理细胞裂解后，再进行一系列蛋白质提取， 亚细胞部第一阶段含有可溶于 Tris 的蛋白质，第二阶段含有可溶于 Tris/Triton X-100 (TX-100)的蛋白质和可溶于Tris/SDS的蛋白质，对于T. immobilis，多达64%的细胞裂解物在第一阶段中回收，而第二阶段中为 8%，第三阶段为 1%，总产量为75 %。

反观Tris不溶性部分中，除了核糖体和多核糖体之外，还有两种不同的结构成分、小囊泡和非球形不规则形状结构，大肠杆菌粗包膜制剂的早期 TEM分析表明囊泡结构代表细胞质膜，而非球形结构对应于细胞包膜（外膜+细胞壁）。

到第二阶段后，囊泡结构不再可见，表明内膜蛋白已溶解在 Tris/TX-100中，那么也是第二阶段的一部分，除了核糖体和多核糖体之外，仍然观察到细胞包膜的不规则形状结构，第三阶段既不包含膜囊泡也不包含非球形开放结构，这表明外膜蛋白已溶解在第三阶段中。

SDS-PAGE 分析证实了不动杆菌和大肠杆菌的三种亚细胞组分中的不同蛋白质谱，对于T. immobilis，S0（裂解物）和第一阶段级分的蛋白质谱几乎相同，该结果与计算的蛋白质产量一致，表明大约 65% 的蛋白质可溶于Tris。

裂解物的分析证实在 410 nm 和 450 至 550 nm 处都有高吸收，分数S1的光谱在 410 nm 处显示出一个小峰，但在更高波长处几乎没有吸收，分数S2的光谱在 410 nm 处显示强峰，在 500 nm 处显示宽峰，分别表明存在血红素和类胡萝卜素。

二、基于亚细胞分离，实现预测定位模式。

在 LC-MS/MS 分析中鉴定的蛋白质的预测亚细胞位置在两个物种中非常相似，在分配了亚细胞位置的蛋白质中，预测有632-757种蛋白质是细胞质蛋白质，有315-335种蛋白质被认为是内膜蛋白，另外14-46种蛋白质被预测为外膜蛋白。

这两个物种中，我们观察到许多预测的细胞质蛋白与组分S1相关，而内膜蛋白（例如，SEC易位蛋白）和外膜蛋白一般存在于组分S2和S3中，脂蛋白的特征在于II型信号肽，它甚至可以使亲水性脂蛋白锚定在细胞质和/或外膜上。

这些蛋白质的分级分离模式相似，在所有亚细胞级分中都鉴定出细胞包膜蛋白，在T. immobilis中，有65种表达的蛋白质被归类到这一类，而大肠杆菌中有133种蛋白质，这些蛋白质中的绝大多数是物种特异性的，两个物种中仅存在17种同源蛋白质。

T. immobilis基因组包含多达 28 个BamB大肠杆菌蛋白的旁系同源基因（分子量范围从43到 193 kDa，pI 值从 5.1 到 9.3），其中 3 个在组分 S1（bamB_4、bamB_7、bamB_28）中被完全鉴定，一个在组分 S2 中(bamB_17) 和分数 S3 (bamB_1) 中的一个。

参与核心寡糖 Kdo 合成的细胞质酶 KdsA 在两个物种的组分 S1 中被鉴定，而将多糖的糖亚基连接到 Kdo-lipidA 的 Kdo 转移酶 WaaA 在组分S3中富集.，LpxK是 lipidA 磷酸化所必需的，仅在不动杆菌中的S3级分中被鉴定，而它存在于大肠杆菌中的所有级分中。

对于 MutS，我们在T. immobilis中鉴定了三个旁系同源基因，其中两个仅在 S3 组分中发现，而第三个在 S2 和 S3 组分中均被鉴定，T. immobilis中的所有三种 MutS 蛋白都包含 MutS_V 结构域。

并且在 S3 部分中鉴定的两种蛋白质之一包含与大肠杆菌中 S1 部分中鉴定的单个 MutS 蛋白相同的结构域结构。

DNA 连接酶的 LigA 同系物包含不同类型和组合的 DNA_ligase 结构域，大肠杆菌同源物和具有混合分馏模式的不动杆菌同源物呈现出相同的结构域结构，而S3独有变体明显更短。

T. immobilis S3特异性蛋白质还包括核糖核酸酶，如核糖核酸内切酶和核糖核酸外切酶 Rbn的两个旁系同源物，以及 3'-5'核糖核酸外切酶YhaM，核糖核酸酶 Rbn 属于 RNase Z 蛋白家族，是缺乏 3'-末端 CCA 序列的 tRNA 前体成熟所必需的。

在 S3 级分中的 tRNA 修饰酶中，我们鉴定了 MnmE/MnmG 复合物中的蛋白质，这些复合物修饰某些 tRNA 中第 34 位的摆动尿苷，以及 MiaAB 复合物，它甲基硫醇化 tRNA 中第 37 位的残基，读取密码子从尿苷开始。

几种修饰 rRNA 分子的酶在这两个物种的分馏模式中也显示出显著差异，16S rRNA 甲基转移酶 RsmH 仅在大肠杆菌的S1 级分中被识别，而不动杆菌中的两个 RsmH 旁系同源物仅存在于 S3 级分中，尽管只有一两个重复。

三、FIB-SEM断层扫描揭示T. immobilis膜网络结构

研究使用FIB-SEM断层扫描检查了T. immobilis的膜网络，在一系列蛋白质提取后通过 LC-MS/MS 分析了其蛋白质组，重建的T. immobilis细胞显示出由细胞质膜内陷形成的隧道样系统的存在，它将非区室化的细胞质空间与扩大的周质空间分开。

我们通过差异溶解和 LC-MS/MS 分析对不动杆菌（以及作为对照的大肠杆菌）的亚细胞蛋白质组进行研究，在每个物种中鉴定出超过 1,000 种蛋白质，并将预测结果与蛋白质提取模式进行了比较。

在大肠杆菌中, 细胞质蛋白主要在第一个 Tris-EDTA 级分中回收, 内膜蛋白在第二个 Triton X-100 级分中回收, 外膜蛋白在第三个 SDS 可溶性级分中回收。

尽管级分之间有一些重叠，这两个物种之间最显著的区别是，大约 50% 的细胞质蛋白仅在T. immobilis的第三个 SDS 可溶性部分中被识别，而在大肠杆菌中只有不到 10% 。

此研究中的一个关键观察结果是，许多在T. immobilis的 SDS 可溶性组分中鉴定的预测细胞质蛋白，代表了最近进化和高度分化的大型蛋白质家族的旁系同源物，该分析揭示了在Planctomycetales的共同祖先以及Gemmataceae的祖先中通过重复发散大量出现新的蛋白质家族。

T. immobilis中表达的 Ser/Thr 激酶在 Triton X-100 和 SDS 可溶性组分中被鉴定，Pkinase 结构域与各种其他结构域相关，这可能影响分级模式，在大肠杆菌数据集中未发现 Ser/Thr 激酶蛋白。

所以不动杆菌中信号转导类别中大量的 SDS 可溶性蛋白是由于该物种中独特存在的蛋白质的回收，许多 Ser/Thr 激酶可能参与了 Planctomycetes 中最近进化的信号转导通路, 就像 Ser/Thr 激酶域被认为在真核生物的多样化谱系中扩展以满足对新通信途径的增长需求一样。

在T. immobilis的 SDS 可溶性部分中鉴定出 RNA 聚合酶再循环因子 RapA 的两个旁系同源物，并且发现它们具有与大肠杆菌中 Tris-EDTA 部分中鉴定的单个 RapA 蛋白不同的结构域结构。

细菌中的RapA 蛋白与 sigma-70 因子竞争结合核心 RNA 聚合酶，而 RapA 蛋白在真核生物中的功能是使紧密包装的 DNA 更容易被 RNA 聚合酶和转录因子接近，T. immobilis中旁系同源 RapA 蛋白的新结构域结构表明新的或修饰的功能，确定这些是否与真核生物中的功能相似将很有趣。

另一类仅从 SDS 可溶性部分回收的预测细胞质蛋白参与 tRNA、rRNA 的修饰和降解以及核糖体的分解，在我们之前的研究中，许多新的核酸外切酶、核酸内切酶和核糖核酸酶被推断为在宝石科的共同祖先中获得。

真核细胞中的细胞内膜充当运输系统，使不同的细胞过程能够在细胞的不同部分发生，Planctomycetes中复杂的细胞内膜系统通过形成灵活排列的隧道和洞穴，也有可能在时间和空间上实现细胞过程的某种分离。

总结

本研究结果强调了平行逻辑化和结构域改组，作为功能创新和适应 Planctomycetes中更复杂细胞结构的机制的重要性，笔者假设分子过程的开放空间组织代表了向完全分隔的细胞过渡的中间阶段。

观察到的分馏模式非常复杂，本研究可以对这些发现提出多种解释，一些蛋白质可能与新的分子复合物相互作用，而其他蛋白质可能嵌入囊泡内或附着在细胞内膜上。

未来还需要对具有许多旁系同源物的蛋白质家族中的每个蛋白质进行更详细的研究，以确定新结构域组成模式和新功能之间的联系未来的实验研究应特别关注与信号转导、转录调控。

参考文献：

1. 崔天玉，《 RNA亚细胞定位、互作和功能相关大数据资源与分析平台》
2. 谢新蒙,《基于机器学习的蛋白质亚细胞定位预测》
3. 武豪放，《基于ResC-LSTM的蛋白质亚细胞定位研究》