IF 40.5：“细胞球”登上Nature子刊

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细胞球体弥合了体外系统和体内动物模型之间的不连续性，是比二维细胞层更好的体内微环境模型，可用于模拟人体器官。当前用于生成球体的工艺（例如不粘基板）繁琐、耗时、成本高或控制难度大。这些方法都没有模仿细胞外基质 (ECM) 生物的特征，例如调节前体分泌和随后组装成基质和形成细胞间连接。

此外，ECM 蛋白包含各种用于酶促反应的翻译后的修饰，从而动态调节细胞粘附和迁移，例如 ECM 蛋白已识别位点之间的高频率磷酸化。到目前为止，合成材料模拟 ECM 蛋白的动态和瞬时磷酸化具有很大的挑战性。由非共价相互作用形成的肽组件的固有动态结构可能提供解决方案，这是因为肽组件形成水凝胶基质可以模拟细胞培养和组织工程的 ECM。然而，大多数水凝胶是非原位制备的，然后再去包裹细胞，这与细胞围绕原位制备的 ECM 的组织有本质上的不同。本研究团队之前的工作表明，酶反应性 D-磷酸肽组装物可诱导产生 HS-5 细胞球体，但详细机制仍不清楚。此外，尽管肽纳米纤维具有多种功能，但它们的原子结构在很大程度上仍然未知。

来自美国弗吉尼亚大学的Fengbin Wang、Edward H. Egelman和美国布兰迪斯大学的Bing Xu团队合作使用低温电子显微镜来确定由酶响应 D 肽和荧光成像自组装的螺旋纳米纤维的原子结构，以表明 D 肽的转胞吞作用可以诱导产生细胞间纳米纤维/凝胶，这些纳米纤维/凝胶可能与纤连蛋白相互作用，从而使细胞球体成为可能形成。具体而言，具有蛋白酶抗性的 D-磷酸肽会经历内吞作用和内体去磷酸化作用，从而产生螺旋状纳米纤维。在分泌到细胞表面时，这些纳米纤维形成细胞间凝胶，这些凝胶可以充当人造基质并促进纤连蛋白的原纤维形成以诱导细胞球体。如果没有内吞、胞吐、磷酸盐触发或肽组装体的形状转换，那么就不会形成球体。这项研究将肽组装体的转胞吞作用和形态学转化相结合，展示了再生医学和组织工程的潜在方法。相关工作以题为“Cell spheroid creation by transcytotic intercellular gelation”的文章发表在2023年5月22日的国际顶级期刊《Nature Nanotechnology》。

1. 创新型研究内容

本研究报告了利用酶反应性 D-磷酸肽的转胞吞作用（即胞吞作用和胞吐作用）去产生细胞间 D-肽纳米纤维作为水凝胶基质，最终形成细胞球体的策略（图 1）。蛋白酶抗性 D-磷酸肽在内体运输过程中经历内吞作用和部分去磷酸化，从而变成纳米纤维，并且在胞吐作用中充当细胞间水凝胶的基质。使用低温电子显微镜 (cryo-EM)，本研究确定了负责细胞间凝胶化的 D 肽纳米纤维的原子结构。肽纳米纤维和纤连蛋白可能在分泌囊泡中相互作用，从而形成球状体。最大限度地减少内吞作用、阻断胞吐作用、去除磷酸盐触发物或消除肽组装体的纳米颗粒到纳米纤维的转化，可以消除细胞球体的形成。使用蛋白酶抗性、酶反应肽通过产生螺旋纳米纤维作为细胞间凝胶/基质用于 ECM 重塑来模拟 ECM 生物特性，这项工作说明了一种多功能方法，将转胞吞作用与肽组装的酶促形态转化相结合，用于再生医学和再生医学的潜在应用组织工程。另外，本研究用碱性磷酸酶 (ALP) 处理 NBD-ffspy（高于其临界胶束浓度去产生水凝胶。应变扫描显示 ALP 处理的快速水凝胶化用时大约 1.5 h，并确认了 NBD-ffsy 组件充当凝胶基质，这与 ALP 快速将 NBD-ffspy 转换为 NBD-ffsy 的认知是一致的。对NBD-ffspy 在指定时间点添加 ALP 的透射电子显微镜 (TEM) 图像显示，在添加 ALP 之前不存在原纤维或其他高级结构。引入 ALP 后，NBD-ffspy自组装成纳米纤维，并最终在 24 小时后形成缠结网络。随着时间的推移，束直径逐渐增加并变得更加分散，这表明 NBD-ffsy 组件是多态的。

图1 自组装D肽纳米纤维形成细胞间水凝胶

NBD-ffsy 的冷冻电镜成像和无参考二维分类证实了其中存在多态性交叉 β 细丝（图 2），四种不同的物质占约总长丝的36%、30%、18% 和 16%。本研究在几乎所有淀粉样蛋白结构中都观察到了这种多态性（例如 KFE8）。本研究通过反复试验测试了由平均功率图谱索引的所有可能的对称性，直到在每个物质中都发现可识别的肽特征时为止。最主要的细丝种类（第 1 类）具有 0.48Å 的螺旋上升和 35.8 的扭曲结构，通过FSC估计的分辨率约为 3.10Å。细丝重建显示 NBD-ffsy 分子是平行交叉β堆积形态，其中的杂芳族 NBD 指向中心，而亲水性丝氨酸-酪氨酸则指向细丝外侧。细丝通过广泛的 β-折叠氢键和 NBD 与 D-苯丙氨酸之间的芳族-芳族堆叠相互作用保持在一起的。2 类细丝的3D重建可达 ~3.2Å 的分辨率，具有4.8Å的螺旋上升和-1.7 的扭曲结构。细丝模型具有 C3 对称性，每个不对称单元包含 NBD-ffsy 的六个拷贝。2 类细丝的交叉 β 堆积结构取决于酰胺之间的氢键和 NBD 基序之间的 π-π 堆积结构。NBD-ffsy 的多态性组装包括另外两种具有不同分子堆积的物质。

图2 NBD–ffsy 和 BP–ffsy 在体外自组装成交叉 β细丝

HS-5 细胞可以作为检测 D 肽组装体形态发生变化的可靠检测方法，因为它们在正常培养条件下能够保持单层结构，并且在过度堆积时几乎不会形成细胞团块。在无毒浓度（ 500μM）下，NBD-ffspy 会在粘附和悬浮的 HS-5 细胞中产生球体（图 3）。特别是，NBD-ffspy 在 12 小时内迅速诱导悬浮细胞聚集。球体大小与浓度呈正相关，并且与聚-D-赖氨酸培养皿涂层呈负相关，这表明 NBD-ffspy 促进的细胞-细胞粘附超过了细胞-基质粘附强度。随着球体在新鲜培养基中逐渐解离，细胞间荧光消失，解离过程中一些相邻球体会发生融合。可逆细胞聚集与 D 肽之间的动态非共价相互作用一致，D 肽将 HS-5 细胞“粘合”在一起。细胞核和活细胞/死细胞染色证实了 3D 细胞聚集体的形成，这个过程伴随着坏死核心和从球体外围到中心的活细胞逐渐减少。F-肌动蛋白染色显示细胞骨架的重排列。在外围的定向分布表明球体被压实。钙粘蛋白染色证明了细胞-细胞连接，这在富含 E-钙粘蛋白的 MCF-7 球状体中更为明显。液相色谱-质谱分析显示来自球状体的组件中含有20% NBD-ffspy 和 80% NBD-ffsy。它们以这种比例混合在 PBS 中形成纳米纤维。

图3 来自粘附和悬浮 HS-5 细胞的球体由与纤连蛋白共定位的细胞间水凝胶组成

受细胞纤连蛋白合成的启发，涉及可溶性蛋白质二聚体的分泌并随后自组装成不溶性基质，本研究关注了转胞吞作用在球体形成中的作用。首先使用不同途径的内吞作用抑制剂，发现氯丙嗪是一种网格蛋白介导的内吞作用抑制剂，可显着降低 NBD-ffspy 的细胞摄取强度。由于氯丙嗪对 HS-5 细胞的毒性，本研究转向由他莫昔芬诱导的发动蛋白三重敲除 (TKO) 小鼠成纤维细胞以减少内吞作用。在验证成功敲除 (~90%) 后，共聚焦图像显示每个细胞的囊泡数量减少，同时球体尺寸减小，表明内吞作用在球体形成中的关键作用（图 4)。另外，本研究使用三种类型的胞吐抑制剂来抑制分泌：（1）维拉帕米（Ver）用于抑制钙依赖性胞吐；(2) brefeldin A (BFA) 用于抑制常规内体运输；(3) vacuolin-1 (V-1) 和蔗糖用于诱导空泡形成，其中V-1 可防止非常规内溶酶体分泌。通过无毒浓度处理 HS-5 细胞，所有三种抑制剂都会破坏粘附和悬浮 HS-5 细胞中的球状体形成。

图4 胞吞作用和胞吐作用对于球体形成至关重要

为了确定去磷酸化是通过胞外磷酸酶发生在细胞外，还是在内体运输过程中发生在细胞内，本研究在培养基中添加了 ALP。添加细胞外 ALP 可减少细胞间组装和细胞聚集，除非将 ALP 稀释至超低水平（例如，0.001 U ml–1）（图 5）。此外，抑制 SJSA-1 细胞过表达的组织非特异性 ALP (TNAP) 会增加由 NBD-ffspy 或 BP-ffspy 处理的 SJSA-1 的球体尺寸。TNAP 抑制导致肽纤维与纤连蛋白发生共定位，而纤维则在整个细胞中形成，并且在未抑制的 SJSA-1 中很难与纤连蛋白进行定位。这些结果支持了 NBD-ffspy 在内体运输过程中主要经历细胞内去磷酸化以产生细胞间组装，并表明细胞外去磷酸化不利于纤连蛋白共定位，从而阻碍球体形成。

图5 细胞内去磷酸化对于球体形成至关重要

本研究对用罗丹明-纤连蛋白 (rFN) 和 NBD-ffspy 孵育的 HS-5 细胞进行了活细胞成像。HS-5 的快速处理源自血浆的 rFN 以形成纤维状结构，而 NBD-ffspy 经历点到原纤维的转化并与 rFN 逐渐共定位（图 6）。rFN 的大小随着它在 24-72 小时内与 NBD-ffspy 共定位而增加，表明 NBD-ffspy 促进了纤连蛋白的重塑。NBD-ffspy 和 rFN 在 4 小时内在内体中表现出早期部分重叠，随后在 24 小时内开始细胞间共定位，在 48-72 小时内逐渐实现良好的重叠。在无细胞条件下，将 rFN 与 ALP 或 NBD-ffspy 一起孵育可保留球状结构，而与 NBD–ffsy 的纳米纤维共同孵育，无论是预组装的 (NBD–ffsy) 还是酶促形成的 (NBD-ffspy +ALP)都有助于原纤维生成rFN。NBD-ffspy 诱导的拥挤可能会促进rFN 聚集体的生成，在添加 ALP 时，rFN 聚集体会从聚集体转变为纳米纤维。降低初始 NBD-ffspy 浓度会减小聚集体的大小。共定位分析显示 rFN 在没有 ALP 的情况下具有来自 NBD-ffspy 的背景荧光，而与 NBD 纳米纤维一起孵育会增加共定位强度。

图6 D-肽纳米纤维促进纤连蛋白的原纤维形成

2. 总结与展望

简而言之，本研究关注了在 HS-5 细胞的细胞间隙内形成的 D 肽纳米纤维的结构和机制，它能够在粘附和悬浮条件下能够迅速形成球状体。研究结果表明，自组装基序、磷酸盐和纳米颗粒到纳米纤维的转化对于球状体的形成是必不可少的。具有磷酸酪氨酸残基的 NBD-ffspy 经历转细胞去磷酸化作用会产生与纤连蛋白共定位的细胞间组装体。这些肽组装促进了纤连蛋白的原纤维形成，并充当将细胞粘合在一起的可逆细胞间纳米连接。这个过程会形成一种适应性超分子水凝胶，该水凝胶可重塑内源性蛋白质并控制纳米级和微米级的反应和扩散作用。这项工作说明了整合低温电子显微镜、酶促变形（纳米颗粒到纳米纤维）和细胞生物学（内吞作用和胞吐作用）去模拟 ECM 生物特性是完全可行的。这项工作中采用的方法应该有助于指导细胞分化，这是一个研究热点。

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