文丨胖仔研究社

编辑丨胖仔研究社

前言

花粉供应中有多种共生微生物群落，它们为蜜蜂提供了各种好处。微生物本身可能是蜜蜂幼虫发育的主要食物来源。尽管花粉传播微生物在维持蜜蜂健康方面具有明显的重要性，但目前缺乏将花粉传播微生物与幼虫健康联系起来的证据。

我们研究了微生物缺乏饮食对蜜蜂幼虫健康的影响。在一系列的饮食操作中，富含微生物的母系收集的花粉被越来越多的无菌、富含微生物的花粉所取代，然后再喂给发育中的幼虫。

氨基酸和脂肪酸营养生物标志物分析的一致发现表明，幼虫从微生物猎物中获得大量营养，并占据比严格食草动物高得多的营养位置。

我们得出的结论是，与老化花粉供应相关的微生物对蜜蜂健康至关重要，不仅是营养互助者，也是主要的饮食成分。在全球蜜蜂数量减少的时代，保护蜜蜂与微生物的相互作用可能是传粉昆虫保护策略的一个重要方面。

实验背景

蜜蜂是地球上主要的昆虫传粉昆虫群体。管理蜜蜂和野生蜜蜂数量的普遍下降对全球粮食安全和生态系统稳定具有重大影响。

在其他几个众所周知的因素（如栖息地丧失、遗传多样性下降）中，杀虫剂（如新烟碱类）的使用急剧增加与前所未有的蜜蜂损失直接相关。

这些发现限制了许多危险杀虫剂的使用，尽管对成年蜜蜂直接毒性风险较低的其他农用化学品（杀菌剂和除草剂）仍在未经仔细审查的情况下喷洒在开花作物上。

虽然对成虫相对无毒（以蜜蜂的LD50衡量），但很难解释为什么这种“蜜蜂安全”的化合物会导致幼虫蜜蜂数量持续且广泛下降。

几乎所有的后生动物，包括蜜蜂，都与一个多样的微生物群落有关，通常被称为微生物组。群居蜜蜂和独居蜜蜂的微生物组由各种微生物共生体组成，其中微生物可能与其昆虫宿主进行互惠、共生和/或寄生相互作用。

这些生态相互作用统称为蜜蜂-微生物共生体，对蜜蜂的健康有着至关重要的影响.

群居蜜蜂和独居蜜蜂的花粉供应充满了专门的非致病微生物，这些微生物发酵并消耗生花粉，提高了其消化率、“保质期”和营养含量。

这种微生物介导的发酵将顽固的花粉基质转化为预先消化的花粉、蜂蜜、花蜜和各种微生物的营养丰富的混合物，随后作为发育幼虫的主要食物。

花粉供应中的特定微生物类群也有助于长期保存储存的花粉，产生重要的大分子，并提供抵御寄生虫和病原体的保护。

有趣的是，过去对蜜蜂的研究表明，蜂箱储存花粉的微生物群落与蜜蜂肠道的微生物群落不同。这表明，对于蜜蜂来说，这两个微生物群落在各自的微生境中发挥着独特的功能，并且是不可互换的。

总之，在老化、发酵的花粉团中，花粉传播的微生物群落为幼虫蜜蜂提供了广泛的发育益处，因此与蜜蜂的健康状况有关。

蜜蜂的选择

2017年4月，一家商业供应商一批新插上的筑巢芦苇中获得新的芦苇。所有芦苇都是从犹他州凯斯维尔的一个地点收集的，成年雌性在那里从周围未经管理的植被中采集花蜜和花粉。

在实验室中使用消毒剃须刀进行解剖，并根据细胞大小、位置和供应量对卵子进行性别鉴定。为了避免这种性别偏见，本研究只使用了雄性卵子。

花粉的选择

记录每个雄性细胞提供的花粉的新鲜重量，然后将其合并到一个单一的群体中，以减少来自母体提供和遗传相关性的任何偏差。

将收集的质量的一半冷冻干燥，浸泡在95%乙醇中，并在生物安全柜中在杀菌紫外线下干燥过夜。剩余的未经处理的一半代表天然，即非不育花粉（NSP）。

使用大量营养素和矿物质的定量分析来确认灭菌过程没有影响花粉供应的营养成分。先前的研究表明，这种杀菌方法对基质的TP没有影响，对花粉的营养质量也没有显著影响。

实验设计的依据

实验由七种处理组成，根据无菌（SP）和天然（即NSP）的比例而不同（100%、90%、80%、70%、60%、50%和0%SP）。

每个处理由12个重复（n¼12）组成，并使用在单独的48孔板中进行。用适当体积的无菌水对无菌级分进行再水化，以复制天然制剂的水分含量。

通过无菌混合适当重量的再水合SP和NSP来重组花粉供应，使得重组供应的最终重量与最初分配给雄性供应的重量相同。

然后将随机选择的鸡蛋放入一个内衬有无菌锡杯的井中，锡杯中含有花粉。将板松散地捆扎，并在228摄氏度的黑暗条件下保持。幼虫被允许发育，直到它们达到成熟前阶段，其特征是完成苍白的丝茧。

数据收集的表现

每天观察幼虫以记录存活率。为了最大限度地减少处理压力并降低环境污染的风险，在生物安全柜中无菌记录第1、10、15和20天所有存活幼虫的重量。

记录了所有处理的以下幼虫反应变量：存活率、幼虫和前期鲜重以及幼虫发育时间。使用Kaplan–Meier生存图和对数秩检验对幼虫生存率进行了探索，并在地层上进行了汇总。

使用重复测量ANOV A来测试七个处理和四个时间点的幼虫体重之间的差异，然后进行成对比较。

使用单因素方差分析法和事后检验法对前期生物量进行比较。使用Kruskal–Wallis非参数方差分析A比较幼虫发育时间。

Pearson相关分析用于探讨前期生物量和幼虫发育时间与花粉供应的%SP之间的关系。

营养生物标志物分析

随机选择的在100%SP和0%SP上饲养的幼虫的d15N氨基酸的CSIA（每个n¼3）外包给了日本海洋地球科学技术厅。简言之，幼虫用HCl水解，并用亚硫酰氯/异丙醇和新戊酰氯/二氯甲烷衍生。

然后使用气相色谱-燃烧同位素比质谱仪对衍生物进行分析，以量化其同位素特征。我们使用先前建立的陆地C3植物性食物网方程来估计幼虫TP[53，66]；TP¼[（d15Nglu–d15Npheþ8.4）/7.2]þ1。

使用单样本单尾t检验将两组的幼虫TP估计值与TP草食动物¼2.0的检验值进行比较。使用独立样本t检验将100%SP和0%SP饲养的幼虫的TP估计值相互比较。

随机选择的在100%SP和0%SP（各n¼5）上饲养的幼虫的NLFA分析。简言之，使用二氯甲烷-甲醇-50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）的1 2 0.6（v/v/v）混合物提取幼虫脂质。

在48 下24小时后，使用1 1（v/v）二氯甲烷和去离子水对溶液进行拆分，以收集含有总脂质的有机相。

中性脂质通过硅胶固相萃取从总脂质中分离，并通过碱甲醇解转化为脂肪酸甲酯（FAME），并通过十八烷基键合硅胶（C18）反相柱色谱纯化。

不育花粉百分比

使用气相色谱-火焰离子化检测对FAME进行分析，并通过与已知标准物的共洗脱和质谱分析进行鉴定。NLFA的总丰度和相对丰度由色谱图估算。

在将数据转换为自然对数（ln（xþ1））后，使用主成分分析（PCA）比较NLFA图谱，并使用散点图进行可视化，以评估两个治疗组之间的分离。

使用先前确定的绝对细菌生物标志物（a15:0、i15:0、a17:0、i17:0）的总和来计算细菌对幼虫饮食的贡献。

植物和真菌的贡献是基于相对植物和真菌特异性生物标志物的丰度（16:1v13t，18:1v9，18:2v6）计算的。使用独立样本t检验比较两组的相对生物标志物18:2v6和18:1v9（18:2v6/18:1v9）的比率，以区分食真菌和草食性喂养策略。

从头合成的游离脂肪酸的总丰度由12:0、14:1、14:0、16:1、16:0和18:1的总和估计，并使用Mann–Whitney U型检验在两组之间进行比较。

实验结果

使用Kaplan–Meier对数秩检验和成对比较进行的生存分析表明，在具有较高%SP的治疗中，生存率显著较低。

使用重复测量方差分析A来分析七个处理和四个时间点的幼虫体重增加。温室–盖瑟校正（1¼0.59）用于调整违反莫奇利球形度测试的情况（x25¼47:74，p，0.001）。结果显示时间的主要影响显著（F1.77，72.62¼494.92，p，0.0001），和处理（F6,41¼13.14，p，0.0001）。

时间和处理之间也存在显著的相互作用（F10.63,72.62¼11.26，p，.0001）。这种相互作用之后的成对比较表明，虽然第一天不同处理的幼虫体重没有差异，但随着时间的推移，消耗较高%SP的幼虫体重增加较低。

日粮中的%SP对前期鲜重有显著影响（单因素方差分析a，F6,59¼32.97，p，0.0 0 0 1）在100%SP上提高的前期生物量显著低于所有其他处理。

花粉中较高的SP显著延长了幼虫的发育时间。存活率、前期生物量和发育时间的适当成对比较表明，几个处理对之间存在显著差异，这遵循了一个可预测的模式；

即，在消耗较高SP组分的处理中，存活率和生物量可预测地较低，发育时间可预测地较高。

相关分析显示，花粉供应量中的SP与前期鲜重呈显著负相关（r¼20.82，n¼66，p，0.0001），与幼虫发育时间呈显著正相关。

消耗100%SP和0%SP的幼虫TP分别为2.27 0.07和2.79 0.07（平均值+1s.e.）。两种处理的幼虫的TP均显著高于严格食草动物的预期（TP食草动物¼2.0；100%SP:p¼0.03；0%SP:p¼0.003）。

与消耗100%SP的幼虫相比，消耗0%SP的幼虫的TP显著更高。主成分分析的结果表明，第一主成分（PC1）占幼虫NLFA图谱变异的62%。

PC1沿线最高的正因子负荷归因于18:1v7c、18:1v9、14:1b、18:1v5和16:1v13t的更高丰度，而最高的负因子负荷则归因于18:0、10:0和12:0的更大丰度。

从因子负荷中获得的散点图用于基于NLFA曲线可视化喂食100%SP和0%SP的幼虫之间的分离，10只幼虫中有9只根据处理类型聚类。

喂食100%SP的所有幼虫都具有正PC1因子负载并聚集在一起，喂食0%SP的5只幼虫中有4只具有负PC1因子加载并聚集在那里。

喂食100%SP的幼虫的相对真菌和植物生物标志物的比率（18:2v6/18:1v9）显著低于喂食0%SP的幼虫（分别为0.20+0.02和0.31+0.02 mg gdw21）（p¼0.008）。

细菌生物标志物（a15:0、i15:0、a17:0、i17:0）的总和在两组中都很小（不到总NLFA重量的1%），尽管在100%SP饲养的幼虫中的浓度与在0%SP饲养的相比是一半（分别为0.29+0.08和0.60+0.46）。

喂食0%SP的幼虫的游离脂肪酸总丰度（12:0；14:1；14:0；16:1；16:0；18:1）显著高于喂食100%SP的幼虫。

氨基酸营养生物标志物分析的结果表明，幼虫的营养位置明显高于严格食草动物的预期，而且幼虫实际上是杂食性的。

因为微生物是后生动物消费者的营养类似物，所以吃花粉的微生物在功能上是食草动物。当食用富含微生物的花粉时，蜜蜂幼虫从营养级1（花粉）和营养级2（草食性微生物）中获得膳食蛋白质，因此被登记为杂食动物，而不是严格以花粉为食的草食动物。

然而，正如预期的那样，用无菌花粉饲养的幼虫（约30%）的微生物膳食补贴幅度明显低于用天然花粉饲养的幼体（约80%）。

尽管前一组的饮食最初没有微生物，但在实验过程中，无菌花粉可能会重新定植（尽管很慢）。尽管如此，在幼虫发育阶段早期去除微生物大大降低了一种重要膳食资源的可用性。

这将解释与食用充满微生物猎物的花粉的幼虫相比，食用无菌花粉的幼虫的营养位置显著降低的原因。

从相对真菌：植物生物标志物的比例（18:2v6/18:1v9）中也注意到了类似的趋势，与喂食天然花粉的幼虫相比，喂食无菌花粉的幼虫的比例明显更低。

这些数据表明，当蜜蜂的饮食中没有微生物时，幼虫表现出草食性进食策略，更多地依赖植物性饮食。相比之下，以富含微生物的天然花粉为食的幼虫更具食真菌性。

此外，在用天然花粉饲养的幼虫中，游离脂肪酸的丰度高出近15倍，这表明这一群体更适合。

这些结果表明，花粉供应中的微生物构成了幼虫的重要饮食成分，当微生物减少和/或被排除在饮食之外时，幼虫对花粉营养物质的依赖性更强。

结合我们早期的研究结果，我们得出的结论是：

蜜蜂幼虫在发育过程中吸收了大量微生物衍生的蛋白质和脂质，花粉传播微生物的缺乏对幼虫的适应性产生了不利影响。

对于实验的思考

尽管有强有力的证据表明花粉传播的微生物与蜜蜂的健康状况有关，但我们的研究中看到的趋势可能是由于幼虫肠道微生物组的改变。

虽然它们是蜜蜂健康的关键因素，但过去对群居蜜蜂的研究表明，肠道微生物群主要作为营养共生体发挥作用，并且往往与与蜂箱储存的花粉相关的微生物群明显不同。

与大量被吃掉和同化的花粉共生体不同，肠道微生物群似乎与宿主共同进化，并在真正的互利共生中茁壮成长。

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