His标签蛋白纯化全攻略！

标签蛋白纯化简介

蛋白纯化是将目标蛋白从实验样本的总蛋白中分离出来，同时仍保留目的蛋白的生物学活性及化学完整性。选择合适的标签不但有利于蛋白的纯化，促进蛋白的可溶性，同时也不能影响蛋白的结构功能和下游应用。以下简单列举几个常见蛋白标签：

表1. 不同蛋白纯化标签介绍

翌圣His纯化填料

Ni-NTA/TED Agarose Resin是以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联NTA/TED为配体，螯合镍离子（Ni2+）而制备成的一种介质。

表2 不同配体所构成填料的性能比较

产品测试数据

Ni-TED Agarose Resin 6FF测试：

1.样品：菌液超声破碎离心后的上清，过滤后纯化

2.纯化方式：装5 mL,重力柱纯化

3.纯化方式：上样2次

洗杂方式：10 mM咪唑洗杂100 mL

洗脱方式：30 mM咪唑洗杂30 mL；50 mM咪唑洗杂30 mL；250 mM咪唑洗杂30 mL。

图1. Ni-TED Agarose Resin 6FF纯化效果图

HisSep Ni-NTA Agarose Resin测试：

1.某知名品牌his纯化产品；

2.大量生产的FF高流速产品；

3.小样生产的FF高流速产品；

4.his树脂（20502ES）；

缓冲液：各个处理组均为1ml树脂纯化200 ml菌液；洗杂使用25mM的咪唑，洗脱液为250mM的咪唑。

His纯化树脂结合效率测试，与市场知名品牌进行对比，Yeasen研发的20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin （4号）具有良好的结合效率。如下图：

图2. HisSep Ni-NTA Agarose Resin纯化效果图

FAQ

01

His标签蛋白不挂柱怎么办？

1.His标签是否丢失 

大肠杆菌表达外源蛋白过程中，常出现序列丢失的现象，若是标签丢失，蛋白自然就无法挂柱了。可采用Western-Blot方法通过His抗体检测目标蛋白是否存在His标签。若可以检测得His-tag，那么就有可能与蛋白质的结构有关，标签被“包埋”而暴露不出来了，这样自然也是无法挂柱的。可以尝试一下把该标签构建于该蛋白质的另外一端，比如 原来是在N端的，改为在C端；

2.His标签是否暴漏在融合蛋白表面，可通过蛋白中适量的加入尿素或盐酸胍等变性剂，如可以挂柱，说明标签暴漏不充分，可尝试变性纯化。若因实验不能变性，只能尝试改变上游条件，要么增加his长度，提高标签暴漏机率，要么修改his标签位置。

3.另外请确认一下层析buffer，别搞错了平衡液和洗脱液，同时再确认一下洗脱液的配方是否 正确，如果使用咪唑进行洗脱的，其浓度是否足够了，一般最高用到500mM。

4.增加孵育时间

02

His标签蛋白挂柱后洗脱不下来有什么办法？

1.蛋白挂柱洗不下来是因为洗脱条件太温和没有破坏蛋白挂柱的结合力造成的

• 增加咪唑浓度或降低PH加大洗脱的强度。
• 可能有其他非特异的吸附力，洗脱缓冲液加入去垢剂（0.2%的TritionX-100）。
• 蛋白可能沉淀到柱子内部了，尝试降低上样量避免蛋白沉淀。

2.HIS标签蛋白纯化出来不纯怎么解决？

• 柱子没平衡好。增加平衡的时间。
• 洗脱拉咪唑梯度太大，可以拉梯度更细一些。
• 非特异性吸附多，平衡缓冲液中加20mM的咪唑和400mM的氯化钠减少非特异性吸附。
• 双标签纯化，在蛋白上同时添加His标签和Strepll标签，进行两步亲和层析

03

纯化填料加入样品之后变黄？

样品中含有填料不能耐受的还原剂，导致Ni的脱落。

• 选用还原剂耐受性更好的填料，如Ni-TED Agarose Resin 6FF。
• 在样品过柱结束后 用不含DTT的buffer冲洗进行后续纯化就可以了。