中国农科院开发T-LOC工具系统分析转基因作物插入位点

近日，中国农科院植保所作物病原生物功能基因组研究创新团队在国际知名期刊《植物生理学》（Plant Physiology）在线发表了题为“T-LOC: a comprehensive tool to localize and characterize the T-DNA integration sites”的论文，该研究开发了一个分析T-DNA插入位点分子特征的流程T-LOC。

农杆菌介导的T-DNA转化是植物基因工程的核心技术，被广泛应用于基础科研和遗传育种研究。T-DNA在植物基因组中的插入位点以及插入到基因组的T-DNA数目都是随机的，且插入的T-DNA片段经常会突破左右边界的限制。此外，通过其它方法包括基因枪介导转化、原生质体融合、花粉管通道法转化等产生转基因植物的外源DNA片段的具有类似的特性。转基因植物的分子特征（T-DNA插入位点、插入拷贝数、插入序列、以及对基因组造成的变化等）是转基因植物安全评价的主要内容和核心，同时也是影响转基因植物性状的重要指标。传统上，southern杂交、荧光定量实时PCR可以用来评估T-DNA的拷贝数，基于PCR的染色体步移技术（TAIL-PCR, Adapter-PCR）经常被用来分离T-DNA的插入位点，但是上述方法只适用于T-DNA插入片段比较简单的转基因植物，且操作复杂、耗时较长。

转基因植物的高通量基因组测序数据已开始被应用于评价转基因植物的T-DNA插入片段的分子特征，目前已经开发TDNAscan，但是在多种T-DNA插入情况下，TDNAscan不能正确评估T-DNA插入位点，同时TDNAscan不能评估转基因对植物基因组造成的变化。该论文开发了分析T-DNA插入位点的流程T-LOC （https://github.com/sfli001/T-LOC）。利用全基因组测序数据、植物基因组序列和转基因载体序列，T-LOC输出转基因组植物的所有T-DNA插入位点分子特征信息：包括T-DNA插入位点模式图、T-DNA和植物基因组嵌合测序read序列、植物基因组插入位点测序reads分布图、以及T-DNA插入位点上下游1kb植物基因组和载体序列。

利用48个转基因水稻植株的全基因组测序数据，研究人员对T-LOC的性能进行了全面的评估。T-LOC从48株水稻中分离到了75个完整的T-DNA插入位点（含左、右T-DNA插入位点），包括左右边界定义的单个T-DNA、串联或倒置重复的T-DNA、带或者不带抗性筛选标记的截短T-DNA、携带T-DNA左右边界之外的T-DNA骨架、多个完整和截短的T-DNA串联体、T-DNA插入片段和转基因植物之间的超短片段DNA等。研究人员还发现了T-DNA片段可以与农杆菌的质粒DNA片段融合后插入植物基因组。T-DNA插入植物基因组的同时，会引起植物基因组的变化，包括植物基因组的短片段缺失、基因组片段复制、植物基因组完美修复、和植物染色体重排，T-LOC可以提供转基因植物基因组的变化。研究人员对这些研究结果通过PCR扩增、sanger 测序和Nanopore长read测序进行了验证，进一步证明了T-LOC是分析转基因作物插入位点分子特征的有效工具。

中国农业科学院植物保护研究所李少芳博士和周焕斌博士为该论文的共同通讯作者，李少芳博士和本科实习生王晨阳为共同第一作者。中国农业科学院植物保护研究所周雪平教授和复旦大学尤辰江博士也参与了该项研究。该研究得到中央公益性科研机构基础研究基金项目资等项目的资助。

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