编辑：医学喵记事
文字：医学喵记事

前言：

兴奋性和抑制性视蛋白的光遗传学操纵对神经科学研究有着至关重要的作用。

然而，如何实现双向控制以及在不同神经元群体中独立激活光遗传学执行器却是科学界一直以来存在的问题。

为解决这些问题，我们在本篇论文中提出了一种名为BiPOLES的光遗传学工具。

通过使用两种不同波长的光，BiPOLES能够实现有效的神经元激发和抑制。

它支持单光子或双光子激发，可靠地实现双色神经元尖峰和沉默，并实现膜电压的光学调谐。

此外，BiPOLES还允许使用第二个蓝光敏感的视蛋白来独立地控制两个不同的神经元群体。

在此之前，我们已在多个模型生物中验证了BiPOLES的实用性，包括蠕虫、苍蝇、小鼠和雪貂。

这一创新工具的引入将为神经科学研究提供更强大、精确的工具，促进科学界对于神经元活动更深入的理解。

一、实验背景介绍

一直以来，为了深入的研究特定神经元群体的特定行为、认知任务或病理状况中的作用，光遗传学操作都是作为不可或缺的实验手段存在。

然而，双向控制同一神经元群体的兴奋和抑制通常需要分别进行实验，这会导致实验复杂性和困难加大。

如何在同一细胞中共表达两种视蛋白需要克服有效膜运输、相等亚细胞分布和光电流幅度等也是不小的挑战。

为了解决这些问题，我们引入了一种名为BiPOLES的创新光遗传学工具，可以使用不同波长的光同时实现神经元的激发和抑制。

这使得我们能够精确调控神经元活动，这包括单光子或双光子激发、双色神经元尖峰和沉默、膜电压的光学调谐，以及独立控制不同神经元群体。

在本次实验中，BiPOLES不仅为双向神经元操作提供了更强大、更精确的手段，也将有望推动人类对神经元活动的深入研究。

二、实验材料准备

2.1 BiPOLES 工程和 HEK 细胞的生物物理表征

首先，通过结合了蓝光或绿光敏感的阴离子传导视紫红质通道蛋白（ACR）Aurora 11、iC++ 19、Gt ACR1和Gt ACR2与红光敏感的阳离子传导视紫红质通道（CCR）Chrimson。

另一方面，我们融合了蓝光敏感的Gt ACR2与红光敏感的CCR bReaChES、f-Chrimson、vf-Chrimson和ChRmine。

通过连接体包括Kir2.1膜运输信号、不同排列的荧光蛋白以及大鼠胃H+/K+ ATP酶（βHK）的跨膜β螺旋，以确保视蛋白通道的正确膜拓扑结构。

随后在人胚胎肾（HEK）细胞中表达这些融合构建体，并在氯梯度存在下记录蓝光和红光诱发的光电流，以便我们进行更详细的生物物理评估。

在所有的实验构建体中，蓝光激活电流向氯离子梯度移动，而红光激活电流则向质子和钠的能斯特电势移动，这表明存在两种通道的功能性膜插入的现象。

在不同构建体之间，光电流密度和反转电位存在显著差异，这取决于融合通道的特性、序列和连接体。

我们团队在这次实验还使用了优化的连接体，不需要荧光蛋白即可维持通道的功能，这相对于以前的策略表现更为优越。

这也说明，BiPOLES确实能够选择性地激活大阴离子和阳离子电流，具有最大的光电流密度和膜电位接近单独表达通道的特点。

2.2 CA1 锥体神经元 BiPOLES 的评估

在另一个实验，大鼠海马切片培养物的CA1锥体神经元中，我们观察到光照触发的光电流具有与HEK细胞中相似的生物物理特性。

膜定位的BiPOLES在体细胞树突区表达最强烈，尽管部分蛋白在细胞核周围有积累，这表明膜运输有待改进。

为了增强膜运输，我们生成了体细胞靶向变体（somBiPOLES），通过添加C端Kv2.1运输序列。

与BiPOLES相比，somBiPOLES的蓝光和红光介导的光电流增强，强度与表达Chrimson或体细胞靶向Gt ACR2（som GtACR2）相当。

somBiPOLES和Chrimson的神经元的被动和主动膜参数与非转导的野生型神经元相似，这表明该神经元耐受性良好。

在验证somBiPOLES在CA1锥体细胞中有效表达后，我们对其进行了基准测试，与分别表达Chrimson或som Gt ACR2的海马CA1锥体神经元进行了直接比较。

在锥体细胞中，somBiPOLES可以可靠地驱动动作电位至10-20 Hz，与单独表达Chrimson相似。

通过进一步测量了somBiPOLES的沉默能力，我们团队发现它能够通过改变电流的方式有效地抑制动作电位的触发。

这与目前最先进的双色光遗传学工具eNPAC2.0进行比较，somBiPOLES在神经元激活和沉默方面表现出类似的效果。

三、实验结果

3.1 DNA以及引物的序列

为了更好的研究HEK细胞的表达，我们使用了多种视蛋白编码序列，包括来自Chlamydomonas noctigama的Chrimson (KF992060.1)、CsChrimson (KJ995863.2)，以及来自Rhodomonaslens的ChRmine。

此外，为了降低实验的偏差，我们还使用了来自Guillardia theta的iC++ (Addgene #98165)、Aurora (Addgene #98217)、Gt ACR1 (KP171708) 和Gt ACR2 (KP171709)等视蛋白。

同时还引入了蓝移突变体Arch3.0 (M128A/S151A/A225T)，以及融合了Kir 2.1通道的膜运输信号(ts)。

而在神经元表达方面，我们将Gt ACR2-ts-mCerulean3-βHK-Chrimson插入片段克隆到AAV2载体中，构建了pAAV-hSyn-BiPOLES-mCerulean (Addgene #154944)。

通过将钾通道Kv2.1的额外运输信号融合到Chrimson的C末端，生成了体细胞优化膜运输变体pAAV-hSyn-somBiPOLES-mCerulean (Addgene #154945)。

在不同启动子后面构建了其他表达载体，包括pAAV-mDlx-BiPOLES-mCerulean 用于GABA能神经元，pAAV-CaMKII-somBiPOLES-mCerulean (Addgene #154948)用于投射神经元。

这些构建体的命名中包含了与青色荧光标签mCerulean3相关的信息，以便明确表示。

所有的引物序列和DNA插入序列都有详细提供。

3.2 HEK293 细胞膜片钳实验

为了验证细胞膜片表达的合理性，我们团队还将含有稳定谷氨酰胺的HEK293细胞放置在改良的DMEM培养基中培养，其中还添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS）和其他补充物，如全反式视网膜和青霉素/链霉素。

细胞以特定浓度接种到聚赖氨酸涂覆的玻璃盖玻片上，并使用FuGENE HD转染试剂进行瞬时转染。转染后的细胞在两天后进行膜片钳实验。

膜片钳实验使用P-1000微量移液器拉拔器从硼硅酸盐玻璃毛细管制备贴片移液管，并对其进行火焰抛光。

3.3得出的移液器电阻在1.2至2.5 MΩ之间。

接着，我们使用倒置显微镜鉴定荧光细胞，然后使用单色光源（ 7 nm）提供单色光，通过电动中性密度滤光轮减弱光强度，以保持光子通量恒定。光脉冲由单色仪控制。

实验记录使用放大器进行，同时使用数字化仪进行采样和滤波，浴液和移液管溶液的成分分别为特定的离子浓度，以维持特定的实验条件。

所有光强度通过验光计测量，并标准化为物平面。所有的电记录都使用特定的软件进行控制和分析。

在HEK293细胞中进行的实验过程涉及细胞培养、转染、膜片钳实验和电记录等步骤，以研究融合构建体的功能特性。

四、结语

综上所述，本研究成功地开发了一种创新的光遗传学工具，即BiPOLES，用于实现神经元的双向双色控制。

我们证实了通过融合不同视蛋白通道，并在适当的细胞系统中表达，研究团队实现了对神经元活动的精准操控。

BiPOLES的设计巧妙地结合了蓝光和橙红光敏感通道，使其能够在不同光谱范围内实现兴奋和抑制。

不仅如此，通过这项研究，我们团队还展示了对构建体在HEK293细胞和大鼠海马切片中的表达进行生物物理和电生理评估的详细过程，以验证BiPOLES的功能性。