《ACS AMI》：仿生芯片技术！为疾病研究插上翅膀

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无论在分析肺部疾病的机理原因、开发新的诊治方法，还是在评估化学或工程纳米材料的毒性方面，人类肺泡间质模型都将发挥重要的作用。现有临床前模型存在局限性，因为无法复制人类肺泡的解剖和生理特性。

近日，来自美国北德克萨斯大学的Yong Yang教授团队进行了使用寿命延长的仿生人肺泡间质芯片的相关研究。研究成果以“Biomimetic Human Lung Alveolar Interstitium Chip with Extended Longevity”为题于7月18日发表在《ACS Applied Materials&Interfaces》上。

本文开发了人肺泡间质芯片来模拟肺泡微环境，其中包括电纺纳米纤维膜作为基底膜模拟物，用于上皮细胞与嵌入三维胶原凝胶的成纤维细胞共培养、与生理相关的间质硬度、间质流体流动和三维呼吸样机械拉伸。与经孔模型相比，生物仿真芯片大大提高了上皮屏障功能。此外，以胶原蛋白I-纤维蛋白混合物凝胶作为间质的芯片可维持间质的完整性，进一步增强上皮屏障功能，从而使芯片寿命延长至八周以上。

本文从以下5个方面进行具体描述：

1. 人肺泡间质芯片的设计与制造

2. 纳米纤维膜促进紧密上皮的形成

3. 肺泡环境因素增强上皮屏障功能

4. Col I-纤维蛋白间质芯片

5. 仿生间质芯片中的CNT毒性与体内观察结果一致

图1 人体肺泡间质芯片的设计与制作

肺泡壁是一层薄薄的上皮，面向肺泡腔，表面覆盖一层薄薄的液体层，形成ALI。上皮由微孔基底膜支撑，是一道重要的屏障，可防止纳米材料渗入上皮下。上皮周围间质由细胞外基质（ECM）蛋白组成，并含有丰富的间质液。体内研究表明，纳米材料渗入肺间质并与成纤维细胞相互作用是纳米材料诱导纤维化的关键步骤。肺成纤维细胞对MWCNTs表现出硬度依赖性纤维化反应。肺间质液体流动可改变细胞骨架、影响细胞增殖并重塑肺间质基质。本文开发了一种动态人肺泡间质芯片系统，模拟人肺泡的解剖学（纳米纤维膜模仿基底膜）和生理学（间质基质硬度、间质流动和三维呼吸的循环机械拉伸）特征。芯片由共培养部分和气动部分组成，两者均由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成。共培养部分包括一个气室（顶部）和一个间质室（底部），气室和间质室之间夹着一层电纺纳米纤维膜（10微米厚）。人肺泡上皮细胞在气室ALI处的纳米纤维膜上形成了紧密的上皮细胞。间质芯片的解剖学和生理学特性可进行调整和优化，以促进和维持芯片功能。此外，气室、电纺纳米纤维膜和间质室是通过微转移组装（μTA）技术组装到共培养部分。

图2 纳米纤维膜促进紧密上皮形成

通过电纺丝聚己内酯（PCL）溶液制备不同孔径的纳米纤维膜。人肺泡上皮A549细胞生长在这些纳米纤维膜上。10天后，上皮细胞在纳米纤维膜上显示具有连续的紧密连接蛋白ZO-1，而在平面对照组中ZO-1的表达则不连续。一般来说，纳米纤维膜能上调蛋白质的表达，中孔膜和大孔膜上ZO-1和闭合蛋白表达明显高于平面对照组。葡聚糖通常用于评估上皮单层通过紧密连接的旁细胞途径。同样，中型和大型纳米纤维膜的上皮渗透性明显低于小孔膜。

肺泡上皮的基底膜呈现0.75-3.85μm大小的椭圆形孔，微孔膜有利于II型肺泡细胞形成单层，实现异细胞交叉对话，并作为免疫细胞在上皮和间质之间移动的通道。本研究制作了不同孔径的PCL纳米纤维膜，并证实了它们对上皮形成和屏障功能具有促进作用。中孔膜和大孔膜上的闭合蛋白和ZO-1蛋白表达上调，上皮通透性降低，表明这两种纳米纤维膜都促进了紧密肺泡上皮的形成。虽然大孔膜对紧密上皮的促进作用更好，但由于一些大孔的存在，偶尔也会出现渗漏。因此，本研究选择了中等孔径的纳米纤维膜进行进一步研究。

图3 间质芯片增强上皮屏障功能

研究人员用中等孔径的纳米纤维膜构建了间质芯片。胶原蛋白是肺间质基质中最丰富的蛋白质，ColI 凝胶用作芯片上正常人肺成纤维细胞（NHLFs）三维培养的肺间质基质。为了模拟肺泡在呼吸运动过程中经历的循环应变，在频率为0.2 Hz时施加了理论上最大15%的线性应变。为了进行比较，建立了transwell模型作为对照。培养一周后，上皮细胞在芯片上形成致密的上皮层；然而，在transwell模型中，上皮细胞之间的间隙很明显。使用分子量为4和70 kDa的右旋糖苷评估上皮细胞的通透性，这两种物质代表通常通过紧密连接运输的中型和大型物质。结果显示这两种右旋糖酐通过芯片上生长细胞的渗透性比transwell模型低约3-4倍，芯片上的上皮细胞对4 kDa葡聚糖的通透性也比纳米纤维膜上单培养物降低了两倍。总之，与传统的transwell模型和纳米纤维膜上的单培养相比，生物仿生间质芯片具有更好的上皮屏障功能。

图4 肺间质芯片长期使用评估

培养两周后，在芯片上观察到间质基质降解和重塑。胶原凝胶降解相对较快，成纤维细胞会导致胶原凝胶收缩。为了缓解间质恶化，利用纤维蛋白来加固胶原凝胶。此外，与胶原凝胶相比，纤维蛋白凝胶可促进细胞粘附，促进成纤维细胞合成更多胶原蛋白和其他ECM蛋白。因此，研究人员将ColI和纤维蛋白溶液以1:0.1到1:1的体积比混合，制备了ColI-纤维蛋白凝胶，用于肺成纤维细胞的三维培养。添加纤维蛋白增加了间质完整性，延长芯片的使用寿命。在芯片上培养一周后，上皮细胞形成了以ColI-纤维蛋白凝胶为间质的单层。然后从气室吸出上皮细胞生长培养基，形成ALI，并将上皮细胞和成纤维细胞混合培养基灌入间质室。三周后，形成了紧密的上皮细胞。上皮细胞单层、分泌的ECM和电纺纳米纤维膜都很明显。上皮细胞的通透性进一步降低。仿生间质芯片不仅增强了上皮屏障功能，还延长了使用寿命。为了增强间质的完整性，采用了EACA来减少凝胶降解，因为纤维蛋白是由纤维蛋白原和凝血酶的酶裂解和重组形成的，而EACA可阻断纤溶酶或纤溶酶原与纤维蛋白的结合。

总结与展望

本文开发的肺间质芯片模拟人类肺泡解剖学（上皮细胞与成纤维细胞共同培养，通过纳米纤维膜包裹在三维胶原间质基质中）和生理学特征（间质基质硬度、间质流动和三维机械拉伸）。电纺纳米纤维膜促进紧密上皮的形成，生物仿真肺间质芯片增强上皮屏障功能，以ColI-纤维蛋白混合凝胶作为肺间质基质，寿命延长了八周以上。肺泡微环境因素，如纳米纤维膜和间质基质，可以通过微调来维持上皮和间质的平衡，从而进一步延长芯片的寿命。对芯片上的MWCNT进行毒性评估证实生物仿真间质芯片无毒性出现，可完美作为人类肺泡间质体外模型。展望未来，肺间质芯片系统对药物开发和疾病建模将产生重大影响。

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