芽孢杆菌 HTS 102：一种从葡萄牙美利奴羊毛中分离出的新型野生菌株

«——【·细胞外蛋白酶的功能和生理意义·】——»

近年来，酶在工业加工中的应用受到了相当大的关注，主要是由于对环境的关注，蛋白酶对自己已经占ca，全世界酶总销售额的40%，蛋白酶确实是细胞生长和分化所必需的。

因此它们普遍存在于活的生物体中与粪藻荧光单胞藻、铜绿假单胞菌、蜡状芽跑杆菌、地衣芽跑杆菌、扁豆芽抱杆菌、梭菌-sP。

嗜水气单胞菌是迄今为止合成率最高的胞外蛋白酶，从生产的角度来看特别方便，而且在几种bacil-lus属中也观察到了大量的生产力。

作为目前可获得的大量商业蛋白酶的结果，也见证了不断增长的用途组合。

然而越来越高的需求推动了全面筛选新菌株的努力，这些菌株可以产生具有更好特征的蛋白酶或易于开发更低成本/更高产量的工业过程。

例如来自球形芽抱杆菌的有机溶剂稳定的蛋白酶和从枯草芽跑杆菌的乳凝proease进行了描述。

然而我们的原生菌株似乎是相当不同的，所以任何更好的成就要求在其他地方和有关不同物种的不一定与我们的独特菌株平行。

人们早就认识到，生物技术在工业中成功应用的一个主要障碍是酶生产和下游纯化的总成本40%的酶的最终成本实际上来自用于其来源发酵的培养基拉紧。

因此如果寻求经济上可行的工艺，发酵的优化将承担很大的相关性。

每个微生物实际上都有其特有的生长和酶合成/分泌的约束。

因此发现了独特的理化和营养要求，除其他操作因素外，培养基的定性和定量图谱也应针对每种微生物和所需的代谢物进行优化。

例如：细胞外蛋白酶的产生受到C/N比、易代谢糖和氮源的存在/缺失以及特定金属离子的有效性等特性的强烈影响，而曝气速率、接种密度、pH值、温度和培养时间等处理条件也起着关键作用。

通过经典方法优化工艺参数“一次一个变量”的体积变化是非常耗费时间的。

因此当要考虑大量的变量时是昂贵的，尽管忽略了参数之间的相互作用，但这仍然是在微生物系统中获得高产量酶的生物过程工程中最常用的策略。

特别是在工艺优化的早期阶段，对实际影响en-酶的合成产率和速率，结果忽略相互处理相互作用的初步研究是可接受的。

只是为了找到是否有一个因子，影响蛋白酶生产到一个sig，重要程度，进一步优化的最合理范围，包括这些因素之间的相互作用，都因此而有序。

为了克服前面提到的“一时间一次”方法无法精确指出加工参数之间的相互作用，提出了阶乘设计这些设计实际上经常用于筛选影响反应的。

当关键因素超过3个需要测试时，它们通常采用适当的分数形式，以避免需要进行大量的试验。

因此本研究的主要目的是寻找最佳的加工因素组合，以提高羊毛相关的Ba-cillussp菌株HTS102的蛋白酶产量。

这是最近从葡萄牙本地绵羊品种中分离出的一种新菌株，它分泌出一种非常强而稳定的蛋白酶，具有角质分解特性。

在进行了几项比较性的“单因素实时”研究之后，采用了2V6-L分数模糊设计，更好地阐明了与最有前途的加工参数相关的主要效应和双因素相互作用。

并最终提高了该微器官的蛋白酶产率在某种程度上，这种主义足以支撑工业界最终的兴趣。

«——【·通过“一次一个因素”的方法进行初步筛选·】——»

营养液培养基被用作对照;虽然这可能不是工业规模上最便宜的培养基，但其组成的稳定性被发现是技术重现性的决定因素，从而导致我们选择从廉价来源获得的纯介质。

牛肉和酵母提取物，分别取代替代更便宜的碳和氟源，在同等浓度，测试的碳源为淀粉、甘油、乳糖、蔗糖、葡萄糖和果糖，考虑的氮源有蛋白陈、胰蛋白陈、氯化和硫酸。

为了找出芽孢杆菌产生蛋白酶的关键因素，对影响许多细菌产生蛋白酶的10个物理化学因素进行了试验。

HTS102金属离子浓度-10mMFeso01gL-Mgso接种密度、pH值是影响接种量的主要因素。

通过“一次移动一个组分”的方法制备了几种培养基配方，以确定NB的每个组分对蛋白酶原的影响。

筛选出了影响芽抱杆菌产蛋白酶的6个关键因素，HTS102酵母水平提取物和蛋白酶，接种密度，搅拌速度，pH值和培养温度通过2v部分析因，无重复设计进行了优化。

每个因素值的范围是根据文献中的信息选择的，再加上在试验过程中获得的经验。

锥形瓶用1%的新鲜接种物0.60Donm接种，细胞外蛋白酶除非另有说明活性在37 C的36小时潜伏期后进行定量。

本研究所用的微生物是芽抱杆菌，超导102分离自葡萄牙Me-rino羊毛--并正式保存在可公开获取的文化收藏，来自比利时根特BCCMLMG细菌培养物收取。

用0.45um滤池过滤灭菌的无细胞上清液，在660nm处用比色法测定酪蛋白分解程度，采用Folin-Ciocalteu试剂进行蛋白酶活性测定。

蛋白质水解活性的一个单位是指能水解酪蛋白的酶量，使其在37 C的pH值为7.5时每分钟产生的吸光度变化等于酪氨酸的1.0umol。

在整个36小时的培养期内，提取等分试样，使用BCA在562nm处吸光度进行总蛋白测定，蛋白质测定试剂盒再根据供应商的指示。

«——【·细胞外蛋白酶的碳源选择·】——»

在测试的几种碳源中，原始NB培养基配方产生的蛋白酶活性最高，蛋白酶的生产几乎完全重新在葡萄糖存在下压制。

因此碳源不作为优化因素，在考虑氮源的情况下，所有的测试无机和有机化合物似乎阻碍酶的生产，相对于使用平原对照组中观察到的。

当用纯蛋白陈代替酵母膏和蛋白陈时，蛋白酶的产生明显减少，表明酵母膏和蛋白陈可能有协同作用。

为了确定不同成分对蛋白酶活性的影响，参考培养基在一个接一个的基础上进行了富集。

所有测试的组分导致比参考培养基更低的蛋白酶产量，在pH值为4、7和10时，寻求初始pH值对蛋白酶生产的影响。

这些结果表明，芽抱杆菌属HTS102能够在较宽的pH范围内生长和释放蛋白酶。

搅拌速度影响蛋白酶产率符合U型模式在进行的所有四项试验中，培养物在50rpm水平摇动产生的蛋白酶活性低于任何其他测试速率。

令人惊讶的是，根本没有搅拌产生极相似的效果，就像搅拌速度超过50转。

蛋白酶活性在37 C时达到最大，而在30 和55 时获得的活性显著降低即分别为37 C时观察到的活性的23%和25%。

影响最大的营养肉汤组分蛋白酶产率为牛肉提取物，然而碱性NB培养基的其他各组分对酶的产生起着一定的作用，因为它沿一次AP-proach的作用大大降低了酶的合成。

当酵母抽提物和NaCl同时从培养基中排出时，蛋白酶的产量进一步下降，表明naci尽管不是氮或碳的来源，proba-bly在保证蛋白酶合成的适当离子强度方面起着重要作用。

由于需要满足分层条件，术语不能从模型中排除较高的整体F值发现表明，姿势相关的模型提供了一个很好的配合，只有0.17%的机会，这样一个大的值发生由于纯噪声。

因此我们的实验数据符合以下-降低双因素交互作用模型方程:

其中Y是预测响应，是截距项PP是线性效应，B是交互效应，X和X是加工变量，为了确定导致最大蛋白酶产量的每一个变量的水平通过表示蛋白酶活性相对于任何两个自变量，构建了等高线图。

在所研究的各种加工因素组合中，测定的蛋白酶活性在7.40和54.64U-之间相差很大。从基于2v分数因子设计的线性回归分析结果来看，有一种形式是简化的:

开发工业生物工艺的第一步是分离出一种能够产生目标代谢物，并获得足够高产量的菌株这种方法需要密集的筛选。

因此需要对大量菌株进行试验，以确定快速生产菌，甚至是可供选择的有用代谢物有关细胞外微生物产品的常规实验方法是使其在琼脂平板培养基上生长。

然后从产品区的半径来评价产品的微生物能力这种策略在源头殖民地周围扩散开来，在其他地方也有详细说明，当分离用于纺织工业中羊毛的新型改性的产蛋白酶细菌时。

由于碱性蛋白酶的经济价值日益提高，对芽跑杆菌BacillussP，以胞外蛋白酶产量为目标函数，筛选HTS102，包括培养基组成和培养条件。

在分离出一个有前途的特性的菌株后，应该继续优化代谢产物的合成和分泌，以使其工业应用尽可能有吸引力，回想一下，优化协议遵循这里的结果-

通过了两种顺序的方法：第一，用总共24个因素进行的一组单因素实时实验，以便将长列表减少到一个更小、更容易处理的关键因素列表。

第二，2v61分数阶乘设计，只测试6个更相关的关键因素的效果。

在进行了基于“单因素实时法”的综合预筛选后，采用2V6分数因子设计对6个变量进行了进一步的测试。

酵母抽提物、蛋白酶、温度和pH值最终在很大程度上影响了蛋白酶的产生，这一实验方法在统计上证明是充分的并且有显著的改进。

在测试的几个碳源中，没有一个比NB培养基配方的蛋白梅生产率更高。

因此表明培养基中其他成分的存在，而不是牛肉提取物，要么抑制了蛋白酶的产生，要么至少不能促进它的产生，而蛋白酶的合成降低了约93%的葡萄糖含量，可能是由于分解代谢抑制。

由于酵母抽提物和蛋白酶共同产生蛋白酶的结果表明了协同作用。

因此选择了这两种营养物质作为后续的优化步绿，pH7似乎是最适的，但作为一个重要的因素，作为一个重要的因素，也考虑了2v的分式阶乘设计。

通过促进细胞获得培养基中的营养物，同时避免抑制性产物浓度的积累，可以有利地有助于蛋白酶合成，然而，高搅拌速率也会导致细胞破碎，这种困难可能超过上述搅拌的优点。

在高搅拌速率和完全不搅拌的情况下，蛋白酶生产得到的结果基本上是相似的。

这可能是由于氧气供应量少和营养物质获取的内在困难，由于搅拌是经济可行的工业过程的一个重要因素，揽拌速率被选为一个因素进行。

虽然37 似乎是最佳的，但很明显温度是蛋白酶生产的一个重要因素。

它被包括在2v6-部分因子设计，接种密度似乎对酶的生产水平有一定的影响，这无疑是工业规模扩大的一个重要参数，因此这一因素也被包括在后续的优化研究中。

在单因素实时分析单个NB组分的影响后，很难得出下一个优化步骤应该选择哪些营养成分的结论。

因此通过四个独立因素的框架析因设计，进一步研究了它们之间的相互作用，只确定了其中要考虑的浓度范围。

实验是基于以前以NB培养基为中心点的筛选实验的结果，每个实验只进行一次，通过芽抱杆菌对牛肉提取物和酵母提取物水平的反应，在蛋白酶生产方HTS102的依据是：

这个回归方程有很好的拟合性，因为它的复相关系数是0.9695，回忆一下，大于0.75的值表示模型与实验数据的拟合度可以接受。

该系数实际上是模型可以解释的数据中总体变异的估计值，因此我们的模型能够从统计学上解释96.95%的响应变异，“调整后的R2”的值为0.9466，进一步证实了上述模型的显著性，它与“预测的R”。

«——【·细胞外蛋白酶研究结果·】——»

因子之间的相互作用发生在当整体响应不同于它们的组合考虑是独立的，可以很容易地解释两因素交互作用。

因为当一个因素的影响取决于另一个因素的水平时，它就会显示出非平行线。

因此酵母抽提物与pH之间的相互作用证明是重要的，等高线图是对所选因素的响应的二维表示，表面不对称。

因此看不到峰值，因此显然存在着进一步微调我们最终使用rsm模型预测的最优轨迹的空间。