前言

核酸是人体内最基本的生物大分子之一，大量的遗传信息存储在不同核酸序列中。核酸分子主要分为两类，脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。DNA有序序列包含基本的生物基因，并通过信使RNA的序列信息决定生物蛋白的结构，进而决定生物的表征。DNA是脱氧核苷酸的聚合物，单个脱氧核苷酸是由脱氧核糖、磷酸和碱基构成。

构成脱氧核苷酸的碱基共有4种：腺嘌呤（A，adenine）、鸟嘌呤（G，guanine）、胞嘧啶（C，cytosine）、胸腺嘧啶（T，thymine），四种碱基中都含有C、H、N元素，除了腺嘌呤之外，其它三种都有O元素。碱基与脱氧核糖通过糖苷键相连形成脱氧核苷，脱氧核苷与磷酸再通过酯键结合构成脱氧核苷酸。

单链脱氧核糖核酸引物合成

目前引物合成主要采用的是固相亚磷酰胺y三酯法。该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，合成方向为待合成引物的3'端向5'端。

脱氧核糖核酸溶液的配置

在多数DNA活性的实验中，经常使用双蒸水进行溶液配置，这是因为使用双蒸水做溶剂保存时间较长。为保证研究所用的ssDNA在较长时间内有很好活性，故选择双蒸水作为溶剂。

为确认ssDNA样品能发出荧光，且证明可通过荧光特性鉴别不同的样品，故制备了具有随意碱基序列的短链和长链ssDNA样品。考虑到核酸一般的合成碱基数范围为15-30以及核酸的稳定性问题，合成了29个碱基的短链核酸（编号：61191），以及56个碱基的长链核酸（编号：61192）。

两种样品具有不同的碱基数目和序列，用双蒸水配置成了浓度相同的溶液并装入石英比色皿。为进一步研究碱基种类对ssDNA光致发光特性的影响，还设计并制备了只含单一碱基的四种ssDNA样品，即：A28、T28、C28和G28。它们都是具有28个碱基的单链，溶液浓度10μM，未进行修饰。

利用荧光特性鉴别不同ssDNA样品的可行性研究

为证明不同ssDNA样品具有可分辨的不同荧光特性，首先测量了具有不同碱基数目和序列的ssDNA样品（即前述61191和61192）在310-410nm范围内不同波长的激发光作用下的光致发光谱（已扣除水的拉曼谱）。首先，实验表明，在不加入探针或荧光、磷光染料的情况下，两种样品在发射波长λem=400-480nm之间有显著的荧光效应。

通常而言，能吸收波长大于220nm光子的有机分子带有延生的π-电子轨道或共轭双键。而核酸由五碳糖、碱基和磷酸组成的核苷酸分子构成，因此，共轭双键碱基与其他结构的耦合将形成独特的电子能级或能带，从而导致实验观测到的光致发光现象。

其次，进一步得出了核酸样品发光峰波长λem和峰值强度I随激发光波长λex的变化关系，对于两种样品而言，都有激发光光子能量大于荧光光子能量（即：λex<λem）的Stocks红移现象。这是由于两种样品的能带中基态电子被激发后，都通过无辐射跃迁过程进入了亚稳态，并进一步以辐射跃迁方式回到基态，同时辐射出能量较小的荧光光子。

实验结果反映了样品电子能级结构的信息，具体而言：峰值波长λem对应了在λex激发之下发生概率最高的辐射跃迁；而其对应的峰值强度I则反映了两种样品中发生不同跃迁的电子浓度，I越大则发生该跃迁的电子在能带中的浓度也越高。

图（a）中，激发光在350-390nm范围，两种核酸样品的λex-λem关系较为接近，但在λex<350nm和λex>390nm区间则有明显的差异；而图（b）中也能观测到两种核酸样品的λex-I曲线存在差异。实验中还测出了当激发光波长λex在310-410nm之间变化时，两种样品的最强荧光峰位置都是λem=413.6nm。

不同波长的激发光λex激发起413.6nm荧光的强度，反映了不同泵浦光子激发峰值荧光的发光效率η，它与峰值荧光强度的关系为η I413.6。因此得知两种样品发出413.6nm的荧光，其发光效率均随泵浦光波长增大而先增后降，λex为340nm时发光效率最高，但两者间的差异也是清晰而可分辨的。

总之，通过两种样品在上述λex-λem关系，λex-I关系以及λex-I413.6关系上的区别，可以对两种样品进行无标记、无指示剂的光谱鉴别。推而广之，只要能提前测出几组待测样品的荧光光谱特性曲线，针对其中某个未标记的样品，便可通过测出其荧光光谱特性并与已知数据比对的方法鉴定是其类型。

单种碱基ssDNA的荧光特性

对样品61191和61192的研究证明了不同碱基序列和长度的ssDNA具有不同的光致发光特性，利用该性质鉴别样品是可行的。因此，研究ssDNA结构对其荧光特性的影响是一个非常重要和有趣的课题。

考虑到ssDNA的结构特性包含碱基种类、序列、长度等多个方面，它们之间的不同配比和组合又会导致更为复杂的情况，故作为对这一问题的初步探索，针对单种碱基序列的ssDNA进行探讨，研究在链长相同的情况下，不同碱基种类如何影响ssDNA的荧光特性。

通过观察A28、T28、C28、G28四种ssDNA样品的发射波长λem都在350-600nm之间，说明分别只含有A、T、C、G中一种碱基的ssDNA发射光波长范围相同，即四种ssDNA的能级结构有相似性。

此外，含有嘌呤（A、G）的ssDNA在λex=350nm时发光峰最强，而含有嘧啶（C、T）的ssDNA则是在λex=360nm时出现最高发光峰。这证明了只含单种碱基的ssDNA样品最大发光效率ηmax对应的激发波长λex可用于区分嘌呤和嘧啶。

对比四种碱基的分子结构，发现嘌呤和嘧啶中最明显的区别在于嘌呤有两个环，而嘧啶只有一个环，因此，上述区别很可能来自于环键的数量。在图（a）中，四种ssDNA样品，在310nm之后发光峰波长λem随激发光波长λex的变化关系接近于线性变化；在310nm之前，λem-λex关系有很大的差异。

而在图3.5（b）中，Ipeak随着激发光波长λex增加而先增大后减小，峰值处为四种脱氧核糖核酸发光效率η最高的激发波长。结合两个图可知，λex在270-320nm范围时，T28ssDNA样品的荧光强度很弱，这是导致T28的λem-λex上下波动很大的原因。

同时，激发光波长λex=270nm时，A28、T28、C28、G28四种ssDNA样品荧光强度都接近于零，故考虑噪声和误差等因素，要通过荧光光谱区分四种样品，较佳的激发光波长λex范围为280-320nm。

由图（b）中可以看到嘌呤的发光强度较强，嘧啶的发光强度较弱。核酸发生光致发光的现象是由于核酸中有共轭双键，嘧啶中只有1对能产生共轭的双键，嘌呤中G有3对能产生共轭双键、A有4对能产生共轭双键，从而导致了嘌呤的荧光比嘧啶的荧光强。

此外，从分子结构看，嘌呤含有两个环，而嘧啶只含有一个环，也有可能导致会荧光强度的大小。图（b）中还出现了四种脱氧核糖核酸发光强度的大小顺序为IA28>IG28>IC28>IT28的现象，这是由四种样品的碱基中含共轭双键和-C=O取代基的数量所导致的。

共轭双键会增强荧光，从共轭双键的数量上看，可以得出IA28>IG28>IC28、IT28。-C=O取代基会减弱荧光，A没有，G和C有一个，T有两个，因此，最终的效果是IA28>IG28>IC28>IT28。需要指出的是，在激发波长360nm和470nm附近C28与T28的强度大致相等，这很可能是ssDNA与水在这些波段存在一定相互作用导致的。

从荧光峰位置鉴别单种碱基ssDNA样品

为了更准确的从光致发光峰位置区分A28、T28、C28、G28四种核酸，通过λex在280-320nm内样品的光致发光光谱对比图，并且作为对照，也作出了λex=330nm的光致发光光谱。实验结果显示，随着激发光波长的增大，四种ssDNA样品的荧光强度也增强。显然，只有当四种样品的发光峰位置有显著差别时，才能进行比较可靠的鉴别。

因此，可单独（或综合）选择λex=290nm，300nm，310nm及320nm的光谱作为判别光谱，区分四种ssDNA样品，具体而言：当λex=290nm，300nm时，λem_peak_T28<λem_peak_G28<λem_peak_A28<λem_peak_C28；当λex=310nm时，λem_peak_G28<λem_peak_T28<λem_peak_A28<λem_peak_C28；当λex=320nm时，λem_peak_G28<λem_peak_A28<λem_peak_C28<λem_peak_T28。

再将四种ssDNA样品从浓度10μM稀释为浓度N=1μM和0.1μM的稀释液，并测量激发波长λex=290nm，300nm，310nm，320nm对应的光致发光谱。对于N=1μM的样品，当λex=290nm，300nm时，发光峰位置依然满足λem_peak_T28<λem_peak_G288<λem_peak_A288<λem_peak_C28。而当λex=310nm，320nm时，T28样品没有明显的荧光峰。

其中，λex=310nm时，有λem_peak_G28<λem_peak_A28<λem_peak_C28，可以从峰位区分出A28、C28和G28样品，没有峰的就是T28样品。但当λex=320nm时，已经不满足N=10μM时的关系。

当四种ssDNA样品浓度N=0.1μM时，荧光强度非常弱，已经找不到明显的峰。因此区分A28、T28、C28、G28四种ssDNA样品可以选择激发波长λex为290nm和300nm，并且能区分四种ssDNA样品的最低浓度是N=1μM。

从荧光峰强度鉴别单种碱基ssDNA样品

为了能使用荧光峰强度区分四种ssDNA样品，必须有较强的荧光发射效应。基于前面的实验发现，当激发波长λex=350nm和360nm时，所研究的ssDNA样品荧光效应最为显著。图3.8给出了激发波长λex=350nm和360nm时，四种ssDNA样品的光致发光光谱。

对于大部分发射波长而言，基本满足峰值强度关系IA28>IG28>IC28>IT28。将ssDNA样品从浓度10μM稀释为浓度N=1μM和0.1μM，得到激发波长λex=350nm和360nm对应的光致发光谱。浓度N=1μM时，仍然满足IA28>IG28>IC28>IT28关系。

但浓度N=0.1μM时，C28和T28两种ssDNA样品的光致发光谱没有明显的峰，且四种ssDNA样品的荧光强度也再不满足前述关系。因此，使用荧光强度来鉴别A28、T28、C28、G28四种ssDNA样品，可以选择激发波长λex为350nm或者360nm，能区分的最小浓度N也为1μM。

总结

以具有56和29个碱基且序列不同的两种ssDNA样品61191和61192为例，研究了它们的光致发光特性。当激发光波长λex在310-410nm区间变化时，能够在410-480nm波长区间观测到显著的光致发光峰。

两种样品的λem随λex的红移而红移，并且发光峰的强度随λex的增大先增强后减弱。此外，证实了两种样品在λex-λem特性、λex-I特性以及λex-Ipeak特性等方面都存在差异，这种差异反映了两种核酸样品中的能带结构差异和碱基中某些光敏感结构的浓度差异，结合这三种光致发光特性曲线，可以对两种样品进行无标记、无探针的检验和鉴别。

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