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前言

在这篇综述文章中，我们介绍了使用磷酸化酶催化的酶促反应精确合成功能性多糖材料，使之应用于生物医学和组织工程等各个领域。这种特殊的酶促方法已被确定为制备明确定义的多糖材料的有力工具。磷酸化酶是一种用于合成具有精确控制结构的纯直链淀粉的酶。由立体和区域控制的糖苷键组成的结构明确的多糖的精确合成在碳水化合物和材料科学领域引起了人们的广泛关注，以开发新的功能性生物相关材料。

一、磷酸化酶催化的特点

磷酸化酶属于 GT35 家族，通常称为淀粉磷酸化酶、糖原磷酸化酶或 α-葡聚糖磷酸化酶。然而，人们普遍认为，这种酶简称为“磷酸化酶”，因为它是自然界中发现的许多磷酸化酶中作为反应催化剂进行最广泛研究和广泛使用的酶。在自然界中，磷酸化酶催化 α(1 4)-葡聚糖（如直链淀粉和糖原）在无机磷酸盐 (Pi) 存在下的非还原端发生磷酸化裂解，生成 α-d-葡萄糖 1-磷酸盐( Glc-1-P)。

由于该反应的可逆性，磷酸化酶还使用 Glc-1-P 作为糖基供体催化酶促糖基化反应，由此葡萄糖残基从Glc-1-P转移到糖基受体的非还原端以形成α-(1 4)-糖苷键，聚合度 (DP) 高于磷酸化酶识别的最小麦芽低聚糖通常用作糖基受体。从马铃薯中分离出的最常见磷酸化酶（马铃薯磷酸化酶）催化的磷酸解和糖基化反应中使用的最小底物通常是麦芽五糖 (Glc 5 ) 和麦芽四糖 (Glc 4 )。

另一方面，Glc 4和麦芽三糖 (Glc 3) 是在磷酸化和糖基化反应中被从嗜热细菌来源分离的磷酸化酶（热稳定磷酸化酶）催化所识别的最小底物。这些观察表明磷酸化酶的来源强烈影响底物的识别行为。

当反应体系中存在过量摩尔比的 Glc-1-P 与麦芽低聚糖受体时，磷酸化酶存在下的连续糖基化作为聚合的传播发生，产生 α(1 4)-葡聚糖聚合物，即直链淀粉。这种磷酸化酶催化的连续糖基化反应是一种链增长聚合反应，糖基受体通常被称为聚合反应的“引物”，因为反应是在受体的非还原端引发的。

由于磷酸化酶催化的聚合被认为类似于活性聚合，因此生成的直链淀粉的分子量可以通过单体 (Glc-1-P)/引物进料比来控制，并且聚合产物的分布通常很窄（M w / M n < 1.2)。

磷酸化酶催化的酶促聚合可以使用修饰的麦芽低聚糖引物进行，该引物在其还原端共价固定在其他物质上，例如不参与聚合的聚合链。这种修饰的引物通常是多功能的，因为在物质上存在多个非还原性麦芽低聚糖链末端，并且已经产生了各种直链淀粉接枝的聚合物材料，例如直链淀粉接枝的聚苯乙烯，聚乙炔，聚（二甲基硅氧烷），聚（乙烯基）酒精）和聚（l-谷氨酸）。直链淀粉接枝的刷子也是通过磷酸化酶催化的 Glc-1-P 的酶促聚合从共价连接到 Au 和 Si 表面的麦芽七糖引物获得的。

磷酸化酶已证明对识别感兴趣的底物结构具有松散的特异性，因此，使用几种单糖 1-磷酸酯（即 Glc-1-P 的类似底物）作为糖基供体来扩展磷酸化酶催化的酶促糖基化，以获得在非还原端包含相应单糖残基的天然低聚糖。例如，马铃薯磷酸化酶可识别 α- d-甘露糖、2-脱氧-α- d-葡萄糖、α- d-木糖、α- d-葡糖胺和N-甲酰-α- d-葡萄糖胺 1-磷酸盐（分别为 Man-1-P、dGlc-1-P、Xyl-1-P、GlcN-1-P 和 GlcNF-1-P）作为使用 Glc 4 作为糖基的糖基化中的糖基供体受体，分别产生非天然的α-甘露糖基化、2-脱氧-α-葡糖基化、α-木糖基化、α-葡糖胺化和N-甲酰基-α-葡糖胺化五糖。

二、磷酸化酶催化酶促聚合法合成含直链淀粉的功能性多糖材料

除了纤维素、几丁质/壳聚糖和直链淀粉等线性天然多糖外，在天然存在的多糖中也经常观察到支链或接枝结构，其中主链多糖通过共价键与其他多糖侧链功能化。这种化学结构可能有助于实现有前途的特定功能，并证明它们在自然过程中的重要作用。因此，制备明确分枝或接枝人工多糖的有效方法在糖材料研究领域引起了越来越多的关注。

基于上述观点，磷酸化酶催化的Glc-1-P酶促聚合已被用于通过化学酶法合成直链淀粉接枝的功能性杂多糖材料。使用上述修饰的引物实现了一种这样的合成，其中麦芽低聚糖的还原端与多糖链共价连接，因此，在这种情况下，进行适当的化学反应以将麦芽低聚糖固定在主链多糖上，并得到然后将修饰的引物用于磷酸化酶催化的酶促聚合。已采用两种类型的化学反应来制备修饰引物：使用麦芽低聚糖与含氨基的碱性多糖的还原剂进行还原胺化，以及使用缩合剂将胺功能化的麦芽低聚糖与含羧酸盐基团的酸性多糖缩合。

使用前一种方法，壳聚糖（一种在其氨基葡萄糖重复单元的 C-2 位置具有氨基的碱性多糖）被功能化以形成麦芽低聚糖接枝的壳聚糖。然后，通过使用乙酸酐对壳聚糖主链中的氨基进行N-乙酰化，将该材料转化为麦芽低聚糖接枝的几丁质。最后，从几丁质/壳聚糖衍生物的麦芽低聚糖引物末端，直链淀粉链通过 Glc-1-P 的磷酸化酶催化酶促聚合而延长，产生直链淀粉接枝的几丁质/壳聚糖。当聚合混合物在 40-50 C 下缓慢干燥时，会产生直链淀粉接枝壳聚糖的水凝胶。

我们还使用类似的合成方法合成了直链淀粉接枝的纤维素。其 C-6 羟基部分转化为胺基的纤维素衍生物最初是通过其 C-6 羟基的连续部分甲苯磺酰化、叠氮基取代甲苯磺酸酯，然后将其还原为胺基制备的。这种胺功能化的纤维素然后通过还原胺化反应与麦芽低聚糖反应，得到引物麦芽低聚糖接枝纤维素，在磷酸化酶催化的酶促聚合中进一步与 Glc-1-P 反应，产生感兴趣的直链淀粉接枝纤维素。

形成的产物具有非常独特的结构，因为它由两种具有代表性的葡萄糖聚合物，纤维素和直链淀粉组成，它们由相同的重复单元组成，但通过立构和相反的糖苷键连接。当聚合溶液在环境大气中在培养皿中保存数天时，它完全转化为水凝胶，比上述直链淀粉接枝的壳聚糖水凝胶更强。这种干燥技术产生了固体（或薄膜）材料。对薄膜进行润湿使分子再次恢复到水凝胶形式，这一过程可以通过随后的系统干燥和润湿来可逆地转换。

三、磷酸化酶催化酶促反应使用模拟底物合成非天然功能多糖材料

除了使用 GlcN-1-P 作为糖基供体通过磷酸化酶催化的糖基化（葡糖胺化）将含有胺官能团的 GlcN 单元引入麦芽低聚糖之外，还尝试通过酶法生产不同功能的低聚糖通过使用类似物底物 α- d-葡萄糖醛酸 1-磷酸 (GlcA-1-P) 的磷酸化酶催化，其中可以将羧酸基团引入麦芽低聚糖。然而，马铃薯磷酸化酶无法识别 GlcA-1-P，因此无法通过这种特定酶的催化作用产生所需的功能性低聚糖。

有趣的是，人们发现从Aquifex aeolicus VF5 中分离出的耐热磷酸化酶确实识别 GlcA-1-P 并且可以催化 Glc 3的糖基化（葡萄糖醛酸化），这是该酶识别的最小糖基受体，产生含有羧酸基团的酸性四糖。

通过使用上述使用类似底物（GlcN-1-P 和 GlcA-1-P）的磷酸化酶催化的葡糖胺化和葡糖醛酸化反应，高度支化的两性多糖，例如具有碱性 GlcN 和酸性 GlcA 残基的两性糖原，也可以被合成。首先使用GlcA-1-P 对高度支化的多糖进行热稳定磷酸化酶催化的葡萄糖醛酸化，以产生酸性物质，然后使用GlcN-1-P对产物进行热稳定磷酸化酶催化的葡糖胺化，得到两性多糖。

GlcA/GlcN 残基的功能取决于反应中使用的进料比。随着溶液 pH 值的增加，两性产物的电动 ζ 电位值从正变为负。两性产物的等电点值可以通过 ζ 电位变为零时观察到的 pH 值来计算，毫不奇怪，它们取决于产物中存在的 GlcA/GlcN 比率。产生的水凝胶表现出 pH 响应行为，它们在碱性条件下可溶，并在系统酸化后恢复为水凝胶。此外，水凝胶表现出依赖于 pH 值的收缩/膨胀行为。

四、磷酸化酶催化酶促聚合制备直链淀粉超分子材料

直链淀粉构建左手螺旋构象并与各种客体分子形成包合物，通常是单体和低聚低分子量化合物。因此，它适合并入高性能聚合物材料中。这种客体分子结合的驱动力是疏水性相互作用，因为直链淀粉螺旋内部是疏水性的，因此，在水性溶剂中，疏水性客体分子将自发地包含在直链淀粉空腔中。另一方面，关于直链淀粉和更高分子量的聚合物客体分子之间形成包合物的报道很少。

将这些聚合物客体分子包含到直链淀粉空腔中的困难源于需要弱疏水相互作用来驱动络合，因此直链淀粉没有足够的能力将长聚合物链包含到其空腔中。

磷酸化酶催化的酶促聚合形成较短的 α(1 4)-葡聚糖（麦芽低聚糖）为较长的 α(1 4)-葡聚糖（直链淀粉），从而诱导与疏水性客体聚合物的包合物络合。这种用于形成直链淀粉-聚合物包合物的有效方法是通过磷酸化酶催化的直链淀粉在水性缓冲溶剂中的疏水聚合物分散体中的酶促聚合来实现的。这种用于生成此类包合物的合成方法的过程类似于植物藤蔓生长并缠绕在杆上的方式，这就是为什么这种聚合方法被命名为“缠绕聚合”。

疏水性聚醚，例如聚（四氢呋喃）（PTHF）、聚（氧杂环丁烷）（POXT）），已被观察到充当客体聚合物，并已使用这种聚合技术被包含在直链淀粉中。 由于聚合物与直链淀粉空腔之间的相互作用不足，藤蔓缠绕聚合不会与亲水性聚合物（例如 PEG 和其他聚（酯-醚））产生包合物。此外，由于与 PTHF 和 POXT 相比，由于烷基链较长，因此聚（氧杂环丁烷）等强疏水性聚合物无法通过缠绕聚合实现包合。

因此，可以得出结论，客体聚合物的适度疏水性是决定直链淀粉在缠绕聚合过程中是否形成包合物的重要因素。

五、结论

这篇综述提供了磷酸化酶催化的酶促反应有效地提供具有精确控制结构的各种多糖材料的证据。这种人造多糖具有特定和独特的功能，与典型的合成聚合物截然不同。此外，这种酶促方法通常被认为是一种绿色和可持续的过程，因为它通常在温和条件下在水性介质中进行，并且不会产生有害副产物。因此，本综述所述的磷酸化酶催化方法有可能应用于生物医学和组织工程等各个领域的有用和功能性多糖材料的环境友好生产。

参考文献：

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