中科院微生物所开发出新一代耐药细菌的精准消杀技术“ATTACK”

抗生素耐药性（AR）正在对全球健康构成严重威胁。通过积累内在耐药突变或水平转移的AR基因，细菌可以进化为多重耐药（MDR），广泛耐药甚至泛耐药。在2017年世卫组织抗逆转录病原体全球重点清单中，耐碳青霉烯类肠杆菌科、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌和耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（CRAB）被列为最高优先类别。抗菌素耐药性是世界各地的主要死亡原因，有专家预测到2050年因抗菌素耐药性可能导致1000万人死亡。由于新抗生素的开发远慢于AR病原体的出现，因此迫切需要开发新的抗菌策略。

基于CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）的抗菌剂已被提出为对抗抗生素耐药性的有前途的策略。CRISPR是一种将短的入侵DNA片段存储为间隔序列的阵列，引导Cas蛋白识别和破坏再感染的外源DNA/RNA，从而提供适应性免疫。CRISPR抗菌剂由指定细菌基因组靶序列的crRNA和在靶位点产生双链断裂（DSB）的Cas效应器组成。结果，绝大多数病原体将通过突变AR基因而死亡，只有一小部分存活下来。因此，CRISPR抗菌剂可以特异性地根除复杂细菌群落中的AR病原体或治愈其抗生素耐药性，并且已被设计用于靶点消除或重新致敏不同的MDR病原体，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌和粪肠球菌。

然而，细菌对CRISPR抗菌剂的耐药性可以通过突变靶序列或灭活CRISPR-Cas机制来进化。因此，需要更稳定的CRISPR-Cas系统来抵抗这些不需要的遗传变异和Acr蛋白来开发强大的CRISPR抗菌剂。

近日，中国科学院微生物研究所研究团队在Nature Communication上发表了题为“Associate toxin-antitoxin and CRISPR-Cas to Kill MDR pathogens”研究论文。该研究强调了与CRISPR-Cas共同进化的RNA毒素的多样性，这是CRISPR-Cas系统自私特征的基础，并阐明了结合CRISPR抗菌剂和TA抗菌剂的特定而强大的策略；微生物研究所研究团队基于此开发的新一代高效稳定的CRISPR杀菌技术——ATTACK（Associate toxin-antitoxin and CRISPR-Cas to Kill MDR pathogens），以对抗日益威胁的抗生素耐药性。

该研究基于微生物研究所在Science上率先报道一类可以护卫CRISPR-Cas的双RNA型毒素-抗毒素系统——CreTA（CRISPR-regulated toxin-antitoxin）。这些新型TA元件潜伏在CRISPR-Cas系统内部，并受后者的调控，一旦CRISPR-Cas被破坏将释放毒素的表达杀死菌体，可使细菌对CRISPR-Cas元件“成瘾”。CreTA是一种“广谱”抗CRISPR机制，它可以在群体水平上保护CRISPR-Cas免受任何使效应蛋白失活的Acr蛋白和破坏编码cas基因的各种遗传变异，并且可能还可以确保CRISPR-Cas的实质性表达和活性。

研究人员后续发现发现，CRISPR调节的毒素 - 抗毒素（CreTA）模块与不同的1类CRISPR-Cas系统相关联并保护。在第一个CreTA模块表征的Haloarcula hispanica中，CreT是一种抑菌RNA，通过隔离稀有的tRNA物种来阻止细胞生长，而CreA是crRNA的退化变体，其重新编程CRISPR免疫效应子以转录抑制creT。

因此，研究人员认为可以利用这种TA模块来提高CRISPR抗菌剂的稳定性和性能，并在这项研究中提出了一种抗菌策略，即ATTACK。研究团队将其内置于CRISPR杀菌剂中，从而巧妙地使靶标耐药细菌陷入两难：如果CRISPR杀菌剂保持其元件活性，它将切割靶标耐药基因，并导致菌体死亡；而一旦细菌利用各种anti-CRISPR机制将CRISPR-Cas元件失活，CreTA将释放毒素表达杀死菌体。这一ATTACK策略显著提高了CRISPR杀菌剂的元件稳定性和杀菌效率。 　

ATTACK策略的关键是找到适合CRISPR-Cas效应器的CreTA模块，该程序用于杀死致病菌。不幸的是，CreTA模块被证明对其物理连接的CRISPR-Cas位点具有高度特异性，并且迄今为止经过实验验证的CreTA模块都来自古菌物种，应该很难适应细菌CRISPR-Cas效应子。因此，在这项研究中，研究人员首先努力鉴定和表征潜伏在不动杆菌的亚型I-F CRISPR-Cas系统中的细菌CreTA。

通过表征这个CreTA模块，研究人员发现了一种独特的杀菌小RNA，它可能会破坏蛋白质合成。根据之前对CreTA特异性决定因素的研究，设计了这个CreTA模块，使其与鲍曼不动杆菌AYE的CRISPR-Cas效应子兼容，然后将它们整合到一种强大而有效的抗菌剂中，以根除/治愈MDR病原体。

总而言之，该研究阐明了结合CRISPR抗菌剂和TA抗菌剂的特定而强大的策略，基于此开发的新一代高效稳定的CRISPR杀菌技术——ATTACK（Associate toxin-antitoxin and CRISPR-Cas to Kill MDR pathogens），丰富了对抗细菌耐药性的武器库，以对抗日益威胁的抗生素耐药性。