导 语

基因测序技术诞生于人类基因组计划，“人类基因组计划”与“曼哈顿”原子弹计划、“阿波罗”登月计划并称为二十世纪人类自然科学史上的三大奇迹。中国从1999年开始参与人类基因组计划，历经二十余年的发展，中国目前已经成为除美国之外，掌握基因测序自主知识产权的国家，也是全球最大的基因测序仪生产国家。

基因测序技术即测定DNA序列的技术。基因测序是基因检测的方法之一，是指通过基因测序设备对生物样本(组织、细胞、血液样本等)DNA分子的碱基排列顺序进行测定，为生命科学研究、临床诊断和治疗等提供指导的过程。基因测序目前可应用于医疗领域及非医疗领域。基因测序技术，主要有一代测序（Sanger测序）、二代测序（高通量测序）、三代测序（单分子测序）。过去几年，随着众多可大幅改善单样品成本、测序深度和通量的新平台或新技术的出现，测序技术发展迅速，越发强大。面对如此多的测序方法，如何选择合适的平台就成了难题。

本文将带你走进Sanger测序，了解Sanger测序技术的发展及应用。

一、“基因学之父”Frederick Sanger

Frederick Sanger

· 国籍：英国

· 职业：生物化学家

·主要成就：两次诺贝尔化学奖，且都是关于“测序”。

第一次：完整定序了牛胰岛素（A和B形式）的序列，证明蛋白质具有明确构造，于1958年获得诺贝尔化学奖；

第二次：上世纪70年代提出快速测定脱氧核糖核酸（DNA）序列的技术“双脱氧核苷酸链中止法”，Sanger测序即以这一突破性技术的发明者Frederick Sanger博士命名。

由于该方法设计的精巧性和准确性，成为人类基因组计划等研究得以展开的关键之一，并使Sanger与另外两名科学家于1980年共同获得诺贝尔化学奖。

二、Sanger测序原理

》先来了解一下几位测序“参与者”：

引物和DNA模板：引物是互补链的引路者；

DNA聚合酶：可以使底物（dNTP和ddNTP）连接在DNA上的帮助者；

dNTPs（脱氧核糖核酸）：包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP，是DNA合成所需的原料；

ddNTPs（双脱氧核糖核酸）：包括ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP，带有标记，是DNA合成的终结者。

*ddNTP的结构特点决定了当反应进行到使用ddNTP作为互补碱基进行合成时，链的合成将会被终止，产生一段长度小于或等于原有DNA长度的新链。由于终止位置随机，数个反应周期之后将会产生长短不同，但是序列均与原DNA内对应片段相同的DNA链，并且由于加入的ddNTP可控，终止位的碱基类型是已知的。

图1 ddNTP与dNTP的化学结构

》Sanger测序技术原理：

Sanger测序技术最初方法为：测序前先进行PCR反应，将需要测序的目的片段进行扩增，从而使目的片段量达到绝对值，使信号放大。在PCR过程中带有标记的双脱氧核糖核苷酸（ddNTP）会随机地加入到正在合成中的DNA片段里。

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，因此得到的PCR反应产物是一组不同长度的DNA片段。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

图2 Sanger测序法原理

1986年开发了以荧光监测的自动化平台，代替放射性同位素标记，以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪，大大提高了DNA测序的速度和准确性。

90年代出现了毛细管电泳技术，Sanger测序进入了高度自动化阶段，将得到的PCR反应产物通过毛细管电泳分离，并使用激光诱导ddNTP携带的荧光标记发出荧光，荧光经过光栅分光后再投射到 CCD 摄像机上同步成像，经计算机软件分析后显示测序结果。此技术的出现大大降低了测序成本并提高效率，为基因测序的广泛应用奠定了基础。

》Sanger测序法（自动化平台）主要优点：

工作流程简便，操作简单；

准确性高，至今仍是验证测序准确性的金标准；

仪器成本相对较便宜；

测序结果不需要进行复杂的生物信息学分析；

测序的长度长达1000 bp；

NGS 基因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。

Sanger测序法原理明晰，过程缜密，无需推导，无需建库，可直接连续地读取测序结果，准确率可高达99.999%。影响世界的预算达30亿美元的人类基因组计划也是通过Sanger测序得以最终实现。

三、基因测序发展历程

进入新世纪以后，一代测序在除科研实验室开展以外，还在法医系统、公安部门犯罪鉴定、食品安全病原体鉴定等诸多应用领域都已经有了成熟的解决方案。

截至2011年10月，全国公安机关DNA数据库总量达到1074.4万份，2016年增加到4400万份。于此同时，一代测序在临床上经过了十多年的发展，也逐渐建立了完整的体系。随着国内测序试剂盒的上市，很多临床应用的开展取得了不错的成效，包括感染性疾病病原体检测（乙肝病毒耐药，丙肝病毒基因分型，结核分枝杆菌利福平，异烟肼耐药，呼吸道病原体，HPV分型），肿瘤靶向用药（EGFR，KRAS，BRAF，C-kit，PDGFRA），化疗药物毒性检测（DPD，UGT1A1，铂类），心血管类药物检测（ALDH2，CYP2C19）等等。

四、Sanger测序仪T400

Sanger测序仪T400是一款新型国产多通道测序仪，产品由毛细管电泳系统、毛细管阵列、高分子分离胶以及嵌入式软件组成。其基于成熟可靠的毛细管电泳平台实现片段分析（单管多重）和Sanger测序两大功能，支持靶基因测序、二代测序验证、HLA分型、微生物测序、线粒体DNA测序等、微卫星不稳定性（MSI）检测、短片段重复序列（STR）检测、多重SNP分析、多重相对荧光定量分析、多重连接探针扩增法等技术应用。

》工作流程：

· Sanger测序工作流程：

· 多重荧光片段分析工作流程：

》产品特点：

智巧玲珑：

4通道毛细管，体积小巧，提高空间利用率。

易学易用：

中文图形操作界面，触屏操作；无需额外的计算机工作站。

操作简便：

耗材集成式卡夹，即插即用；

装机后自动光路校准，无需人工操作。

结果精准：

基因检测“金标准”平台，技术成熟，结果准确。

平台开放：

具有Sanger测序和片段分析两大功能，应用技术广泛，可搭配市面多种主流检测项目。

》临床及科研应用：

平台开放，应用广泛，可覆盖病原体检测、药物基因组学检测、肿瘤检测、遗传病检测等领域。

尾 语

Sanger测序法的突出优势是长读长及高准确性，准确率可高达99.99%，目前在遗传分析、基因合成的验证、科研级DNA序列的测序验证等领域，有着广泛的应用，是超高精度测序的“金标准”。

回到一开始抛出的问题，面对如此多的测序方法，该如何选择正确的平台。我们的答案是：没有最好的技术，只有最合适的技术。最好的，不一定是最合适的；最合适的，才是真正最好的。