「论文解读」天然海藻酸盐水凝胶珠用于种间和种内双向通讯

*仅供医学专业人士阅读参考

创造一个反映生物系统异质性的微环境对维持生物系统发展至关重要。有利于生物体生长和生存的微环境，应该考虑如质量运输、多孔性、稳定性、弹性、大小、功能和封闭结构中生物体的生化特性等因素。近日，来自美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的Joseph Irudayaraj教授团队进行了用于种间和种内通讯的功能性水凝胶珠中细菌的分级封装的相关研究。研究成果以“Hierarchical Encapsulation of Bacteria in Functional Hydrogel Beads for Inter- and Intraspecies Communication”为题于2023年01月09日发表在《Acta Biomaterialia》上。

图1 实验流程及机制示意图

本文提出一个由天然海藻酸盐水凝胶制作的人工长期封闭模型，结构稳定可以在生理相关条件下接纳生物体超过10天。该封闭平台独特功能是开发分层栖息地，细菌、细胞可以被夹在核心和壳层中，壳层的厚度和数量在制造时可以调整。珠子中水凝胶微环境可以承载生物膜中复杂生物亚群，封装在不同珠子中的细菌菌落或单珠的核心层和分层内的细菌菌落动态互动，以显示物种内交流。同时还研究了益生菌和人类结肠直肠癌细胞之间的物种间交流，证明珠子中的生物体与环境之间存在双向交流。

图2 微生物在生物膜状异质水凝胶中封装

藻酸盐水凝胶层中的微环境可有效促进细菌生长，防止因核壳瓦解而导致的细菌渗漏。本实验利用直径为2毫米的水凝胶珠模拟生物膜状环境。通常情况下，生物相容的培养基中浮游细菌在几小时内达到静止期。自由液体培养的细菌和传统海藻酸盐珠子中生长的细菌之间没有实质性区别，本文设计中，水凝胶封闭后，细菌在珠子内复制并启动细胞物质生产。珠子中单个大肠杆菌放在理想培养基中时可以复制并生长成一个细菌群。水凝胶壳珠作为结构支架的功能，驻留在核心区12小时内形成菌落。菌落大量聚集，并占据可用的内部空间。进一步评估并比较含有60和600个CFU/珠子的组别中EPS成分同时产生和代谢活动情况。细菌细胞总数如预期在核心区增加，聚集体产生的总蛋白量按比例增加。处于不同代谢状态的细菌之间有不同程度的相互作用，总的活细菌数增加。

图3 厚水凝胶层用于长期封闭

为研究细菌在长期封闭过程中变化，研究人员构建了更厚壳层看是否能维持细菌的增殖和定居，同时保持核壳结构的完整性。研究表明，较薄的外层在营养丰富的培养基中在48小时内破裂。较厚的分层珠子可以提供足够的硬度而不破裂。海藻酸裂解酶对水凝胶层的酶解研究表明：结构稳定，没有任何酶的水解。由于水凝胶珠的外壳由与Ca2+交联的天然海藻酸聚合物组成，海藻酸聚合物网络的渗透性主要受到凝胶化的影响，较厚的外壳层并没有明显改变大肠杆菌的生长，珠子内的大肠杆菌在珠子微环境内达到接近饱和点后仍在增殖。被包裹的细胞产生细菌成分可以创造一个密集的环境，抑制底物进入核心区域有效扩散。

图4 细菌衍生功能性珠子和分层固定化

创造细菌来源功能性生物材料的流行策略是通过包裹表达重组蛋白的转基因微生物而开发。但不利的条件或程序可能导致细胞快速死亡或泄漏。构建水凝胶屏障将表达GFP和RFP的大肠杆菌限制在珠子环境内，与传统封装策略相比不同的是细菌细胞倾向于在封装物的外围生长。鉴于海藻酸盐水凝胶的透光特性，不仅可以用肉眼监测细菌细胞，还可以用荧光光谱法。大肠杆菌产生重组蛋白的积累与细胞密度成比例。通过扩展多层制造的概念，各种微生物可以依次被封装在每一层中。分层固定反映生物结构的层次性和异质性，促使复杂的多功能水凝胶结构的发展。

图5 用于物种间和物种内交流的水凝胶珠子调节器

细胞通讯通常使用由细胞内/外信使分子介导的化学信号，不仅支配细胞的基本活动，而且调节着环境中的生理功能。本文由水凝胶核壳珠促成的三个细胞通讯模块。包裹特定细菌的水凝胶珠可以与其他水凝胶调节剂或哺乳动物细胞共同培养。当细胞密度增加到某一阈值以上时，细菌交流的密度依赖微环境。接着构建分层水凝胶结构的分层通讯模式，以证明细菌在异质环境中相互作用。水凝胶核壳珠的核心部位的RFP信号和外围的GFP信号在孵化24小时后检测到，荧光信号的增强是由水凝胶珠核心层包裹NP L. Lactis和壳层包裹NR L. Lactis实时监测。同时研究人员开发了体外共培养系统，证明细菌和哺乳动物细胞之间的动态改变和相互作用。协同培养模型系统为体外研究提供了前所未有的工具，不仅可以评估宿主与微生物的相互作用，还可以评估其他的具体应用。

总之，本文提出一种开发可调控海藻酸水凝胶核壳珠用于细菌封装的策略。具有分层结构的核壳珠可以在生理相关的条件下承载细菌超过10天。此外，水凝胶的微环境可以像生物膜一样支持分层的细菌亚群。细菌可以夹在核心和外壳层中，外壳层的厚度和数量以及细胞密度都可以调整。此外，本研究证实物种内和物种间的交流，显示在完全封闭独立微环境中封装细菌群的动态互动。未来可以对无数生物场景进行研究，以揭示在相关空间尺度上原位微生物功能。伴随着生物膜的封闭，为合理设计具有功能的软体凝胶结构提供了新的见解。未来的实验可以构成工程水凝胶材料，发现更多生物的相互作用。

文章来源：

https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.01.003

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