盘点ADC有效载荷背后的故事：拓扑异构酶抑制剂

拓扑异构酶（TOPs）是一种核酶，它们的作用是使超螺旋DNA松弛，以进行转录和复制。拓扑异构酶分为3大类，即IA、IB和IIA，每一大类中包含多种不同的结构。位于活性位点上的酪氨酸，是实现拓扑异构酶功能的关键，它可以断裂DNA的磷酸二酯键，打开DNA的单链（TOP1）或双链（TOP2），形成各自的瞬时断裂复合物。一旦复制完成，DNA也会在酶的催化下迅速重新连接。

Top1抑制剂通过稳定由拓扑异构酶诱导的瞬时单链DNA断裂，当DNA、Top1和Top1抑制剂三元复合物遇到复制叉时，DNA的双链发生断裂。因此TOP1抑制剂可以被认为是基于拓扑异构酶的毒性物质，而不会抑制TOP1的催化活性。

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作为一种典型的TOP1抑制剂，喜树碱（CPT）是从中国植物喜树中分离出来的植物生物碱，具有新颖的五环结构（图1）。由于喜树碱在水溶液体系中的溶解度很差，这大大限制了其在癌症治疗领域的应用，直到当两种水溶性衍生物——用于转移性结直肠癌的伊立替康和用于卵巢癌的托泊替康——成功获得上市批准时，才激发了人们对于喜树碱类药物作为Top1抑制剂的浓厚兴趣。目前已有大量喜树碱衍生物和E环修饰的类似物在临床上进行了研究。此外，非喜树碱类的Top1抑制剂，如茚异喹啉类和二苯并萘啶酮类的临床评价也是当前研究的热点。到目前为止，在TOP1抑制剂中，只有喜树碱衍生物被用作为ADC有效载荷。

TOP2抑制剂主要包括蒽环类药物和鬼臼毒素衍生物等。

基于TOP1抑制剂的ADC

SN-38 ADC

SN-38是抗癌药物伊立替康（CPT-11）的活性药物形式（图1），在体内通过人肝羧酸酯酶的作用产生。伊立替康主要用于治疗转移性结直肠癌（CRC），并且在肺癌和其他类型的癌症中也显示出抗肿瘤活性。在药效上，SN-38比伊立替康强2-3个数量级。

为了提高SN-38或伊立替康的生物利用度，人们开发出了不同的剂型。如SN-38与聚乙二醇（PEG）形成偶联物、与纳米粒子结合或通过脂质体实现负载，而伊立替康与PEG形成的偶联物已经进入临床研究，这些剂型一般依赖于高渗透长滞留（EPR）效应。

图 1喜树碱(CPT)、伊立替康(CPT-11）和SN-38的结构。SN-38是伊立替康通过人羧酸酯酶的作用在体内形成的。

对于基于SN-38的偶联药物而言，连接子与药物之间的连接位点和形式是一个值得探讨的问题。早期的研究表明，当连接子中具有组织蛋白酶B可裂解部分，并且和药物的20号位通过氨基甲酸酯键连接时，这种ADC在肿瘤细胞系中表现不佳，这可能是由于在细胞内连接子释放游离药物的效率较低。虽然当连接位点转移至药物10号位时（CL2E连接子）的效果更好，但在细胞层面和动物层面的抗肿瘤效果依然不够好。对连接子进行进一步优化，所得到的CL2A结构是一种释放药物速度较为适中的连接子，它以苄基碳酸酯为裂解中心，引入赖氨酸和聚乙二醇增加溶解性，通过马来酰亚胺基团与抗体相连。图2显示了CL2A-SN-38和CL2E-SN-38的结构，每个结构中的马来亚胺基团与抗体（mAb）上的巯基反应。

图 2 (a)基于CL2A-SN-38的ADC结构，包括SN-38作为有效载荷和连接子中的可水解裂解位点。含有这种连接子-药物结构的ADC目前正在进行临床试验。(b)基于含有组织蛋白酶B可裂解肽的CL2E-SN-38 的ADC的结构，其在体内模型中无效。在每个ADC结构中，马来酰亚胺与抗体的巯基反应。

裸鼠对含SN-38的ADC高度耐受，因此在临床前的体内研究中没有达到最大耐受剂量。人们针对滋养层细胞表面抗原2（TROP-2）、癌胚抗原细胞黏附分子5（CEA-CAM5）、人类白细胞抗原-DR（HLA-DR）、CD22和CD74抗原，在人肿瘤异种移植裸鼠体内进行了多项治疗实验，反复确定了这类ADC的特异性。

IMMU-132（Sacituzumab Govitecan–hziy）是将靶向TROP-2抗原的hRS7抗体，和上文提到的CL2A-SN-38进行偶联得到的ADC。TROP-2抗原在多种实体瘤中高表达，而大量的临床前数据验证了IMMU-132对于TROP-2抗原阳性肿瘤的有效性。在荷Capan-1或NCI-N87的小鼠体内进行药代动力学分析，结果表明，与IRI系统治疗相比，单次注射IMMU-132具有明显的优势。IMMU-132运送SN-38进入肿瘤的剂量是伊立替康的20-136倍。而SN-38或葡萄糖醛酸化的SN-38（SN-38G）的肠道浓度是伊立替康的9分之一。SN-38或伊立替康的葡萄糖醛酸化是一种解毒机制，当其转运到肠道后，肠道菌群的葡萄糖醛酸酶对其进一步作用，导致游离小分子药物的释放，从而在接受治疗的患者中造成严重的迟发性腹泻。实验证实，结合物中SN-38的葡聚糖修饰缺失，这可能是IMMU-132治疗患者严重腹泻发生率较低的原因。

IMMU-130同样使用CL2A-SN-38，将其连接到人源化的单抗HMN-14（抗CEACAM5）上，该抗体的裸抗及放射标记形式的安全性已经得到了充分的证明，都进行了临床评估。IMMU-130与IMMU-132类似，在异种移植模型中，相比伊立替康显示了显著的优势。AUC分析结果表明，与伊立替康相比，IMMU-130可以向肿瘤多输送11-16倍的SN-38，而如果考虑到伊立替康和SN-38等效剂量上的差异，这种输送优势将增加30倍以上。该药也进行了针对难治性或复发转移性结直肠癌患者的I/II期试验。

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IMMU-140是将抗HLA-DR的抗体IMMU-114与SN-38偶联所得到的ADC。HLA-DR是MHC II类抗原的一个成员，在肝癌和实体瘤中表达。针对HLA-DR的人源化抗体IMMU-114是一种IgG4抗体，旨在避免Fc介导的免疫功能。在体外，IMMU-140表现出双重作用机制：IMMU-114的非经典凋亡信号和SN-38的经典双链DNA断裂和凋亡。在急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、多发性骨髓瘤（MM）、急性粒细胞白血病（AML）、 弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、霍奇金淋巴瘤（HL）和黑色素瘤等人类肿瘤异种移植模型中，与对照组相比，IMMU-140都提供了显著的治疗效果。其中对MM和HL 肿瘤的治疗效果明显优于裸抗体，这些良好的临床前结果预示着该药物具有潜在的临床应用优势。

基于TOP1抑制剂甲磺酸Exatecan衍生物的ADCs

在SN-38类ADC药物成功的基础上，人们开发出新型的TOP1抑制剂甲磺酸Exatecan （DX-8951F）。它的结构较为新颖（图3a），在喜树碱分子的7位和9位上有一个胺取代的环己烷环，在C-10处有一个甲基，在C-11处有一个氟。分子中的氨基有助于增加水溶性，而由环己烷环所指示的刚性则有利于在内酯-羧酸酯平衡中保持内酯的完整形式。

在设计ADC时，人们对DX-8951F的两个衍生物都进行了评价，这两种衍生物的区别在于氨基上带有不同的取代基：DXD(1)（图3a）的氨基上带有为2-羟基乙酸片段；DXD(2)则是4-氨基丁酸的酰胺衍生物。将酶可裂解的Gly-Gly-Phe-Gly四肽偶联到这些药物衍生物上，连接子的另一端通过马来酰亚胺上，完成ADC的制备，偶联药的结构如图3b和3c所示。

图 3 (a)甲磺酸Exatecan及其衍生物DXD(1)和DXD(2)的结构。(b)基于DXD(1)的ADC，和(c)基于DXD(2)的ADC。B和C中的酶裂解位点用红色箭头表示。

利用上述两种DX8951F的衍生物，人们将其与抗HER2的抗体结合，制备并评估了两种ADC。这两种ADC都是通过将链间二硫键还原所产生的巯基，与linker-payload实现结合，使药物与抗体的比值（DAR）为8。基于DXD(1)的ADC称为DS-8201A，基于DXD(2)的ADC称为抗HER2-DXD(2)。由于这两种有效载荷都是水溶性的，因此即使DAR值为8，也不会导致体内清除速度过快的问题。经过细胞的内化和细胞内加工过程，DXD(1)或DXD(2)被释放出来。前者在生理pH下不带电，因此具有透膜性；而后者由于含有胺基而带电荷，因此膜的透过性较差。在体外和体内实验的基础上，DS-8201A具有穿透弱抗原表达或无抗原表达的肿瘤细胞的优势，即具有旁观者效应。当然这种旁观者效应也有可能对健康细胞造成毒性，因此总体的效用取决于治疗指数，即疗效与毒性的权衡。因此，含有Exatecan衍生物作为有效载荷的ADC具有广阔的发展前景。

图 4喜树碱衍生物与酶可裂解连接子构建的ADC。(a)比CPT更有效的两种衍生物的结构。(b)基于这些喜树碱衍生物的ADC，包括带有酶可裂解的二肽（左）或葡萄糖醛酸酶敏感的连接子（右）。裂解位点用箭头表示。

ADC中使用的其它TOP1抑制剂

科学家们也对其他种类基于喜树碱或其衍生物的ADC，在体内和/或体外进行了临床前的评价。例如，Burke等使用7-丁基-10-氨基喜树碱和7-丁基-9-氨基-10，11-亚甲二氧基喜树碱作为有效载荷，两者的毒性比喜树碱高1-3个数量级（图4a）。用含有可裂解二肽二肽或葡萄糖醛酸的连接子，将这些抗体结合（DAR=4）到抗Lewis-Y抗体BR96、抗CD30单抗CAC10，和抗CD70单抗H1F6上（图4b）。这些ADC在特定的细胞系中显示出免疫特异性抗肿瘤活性，并观察到有效的作用。

除此以外，人们还报道了抗HER2单抗的喜树碱偶联物BR96， 连接子和20-羟基处通过碳酸酯相连，同时连接子中也引入了组织蛋白酶B可裂解的二肽。在另一项研究中，抗HER2的曲妥珠单抗与SN-38形成偶联物，其有效载荷通过赖氨酸残基与抗体偶联。

基于TOP2抑制剂的ADC

阿霉素也是TOP2抑制剂的一个例子，当然它也有其他的作用机制。阿霉素与抗Lewis-Y抗体CBR96形成的偶联物在1993年首次报道，这代表了ADC领域的一个里程碑式的成就。尽管在转移性乳腺癌的II期临床试验中，由于肠道抗原表达导致的毒性，这种ADC在耐受剂量下并不有效，但科学工作者从这些研究中受益良多，也影响了后续ADC设计的过程。由于阿霉素只有中度的细胞毒性，伴随着BR96-阿霉素ADC在可给药剂量下的失败，因此人们的共识是，ADC的有效载荷需要更高的细胞毒性。

基于拓扑异构酶ADC的连接子科学

在传统的ADCs中，由于治疗指数差而不能单独使用的强效药物，通过在体循环中稳定的连接子，与内化型抗体结合。只有在抗体被肿瘤细胞内化并处理后，连接子裂解并释放有效载荷。在某些情况下，例如使用硫醇-马来酰亚胺连接时，尽管在血清中具有良好的稳定性，但由于retro-Michael加成反应的存在，释放的药物可能被血清白蛋白捕获，从而可能在体内随机释放游离的有效载荷。人们通过设计连接子，可以使得偶联反应形成的硫代丁二酰亚胺键自发水解，从而抑制retro-Michael反应。另一方面，连接子-有效载荷组分药物的疏水性可能会加速血液清除过程，这可以通过在连接子中引入亲水性PEG来解决。

对于含SN-38的ADC，研究者最终使用了中等稳定的，基于碳酸苄酯的连接子CL2A，因为发现更稳定的连接子CL2E效果较差，这可能是由于（1）SN-38只具有中等毒性，（2）ADC需要严格通过内化途径发挥作用。在CL2A连接子的偶联物中，由于在人肿瘤异种移植模型中，由于有效载荷可以在细胞内和肿瘤微环境中释放，因此CL2A-SN-38偶联物比CL2E-SN-38偶联物具有明显更好的治疗活性。

DS-8201A偶联物中的连接子是一个酶可裂解的四肽，它还包括一个以亚甲基烷氧基酰胺形式构建的可断裂间隔区，该间隔区旨在释放完整的有效载荷。一旦酶裂解发生，可断裂间隔物被水解为甲醛和氨，从而释放完整的有效载荷。

在含有阿霉素的ADCs中，如BR96-阿霉素和HLL1-阿霉素，可裂解连接子包括在细胞内的酸性pH中裂解的酰腙键。

总结

拓扑异构酶抑制剂是一类新型的治疗药物，其作用机制是与DNA-拓扑异构酶复合物结合，使得DNA双链断裂并最终导致细胞凋亡。作为ADC有效载荷，拓扑异构酶是一种临床试验中ADC所广泛使用的微管蛋白抑制剂的替代方案。目前临床试验中ADC中主要有两种Top1抑制剂作为有效载荷：（1）SN-38和（2）甲磺酸Exatecan衍生物DXD(1)。其中，前者是伊立替康的活性药物形式，在几种癌细胞系中具有纳摩尔级别的细胞毒性。DXD(1)具有更大的细胞毒性，类似于奥瑞他汀和美登素的亚纳摩尔级别的毒性。

预计在不久的将来，会有更多利用TOP1抑制剂作为有效载荷的ADC通过监管批准程序，提供给癌症患者，从而增加临床医生和患者的选择空间。此外，这些ADC也可以与其他方式进行联合治疗，如全身化疗、PARP抑制剂和免疫肿瘤学药物得到，可以扩大治疗的前景。最后，虽然基于TOP2抑制剂有效载荷的ADC没有基于TOP1抑制剂的研究广泛，但人们仍在努力探索这类有效载荷，同时也在继续关注新的肿瘤靶点的发现，以进一步扩大ADC的选择。