标签蛋白大盘点（荧光蛋白篇）荧光蛋白怎么选择？亮度低怎么办？

荧光蛋白在生物学众多研究领域中有着广泛的应用， 基于荧光蛋白的分子探针和标记方法已成为细胞或体内动态成像研究生物大分子或细胞功能的重要工具。自1992年Shimomura 首次从水母 (Aequorea victoria) 中分离出绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)，各种颜色的荧光蛋白被开发出，它们能特异地 “点亮”生物分子或细胞，并显示出生物分子的活动情况，从而能更有助于我们揭示这些分子或细胞的活动规律及本质。

除了绿色荧光蛋白外（GFP），研究人员基于GFP运用突变技术发现了多种颜色的荧光蛋白，并从珊瑚和海葵等物种中克隆出光谱红移的荧光蛋白，目前荧光蛋白按照颜色分类主要分为绿色系、蓝色系、青色系、黄色系、橙色系和红色系。

如何选择荧光蛋白？

• 激发峰/发射峰

每一种荧光蛋白都有其独特的激发波长和发射波长。因此，选择的荧光蛋白必须是所用成像系统能够激发和检测到的。对于单色实验，绿色荧光蛋白是最常用的，选择两种或以上荧光蛋白进行多色成像时，建议激发和峰值发射波长均相隔50-60nm以上。

对于两种颜色， EGFP+mCherry几乎在所有荧光显微镜和流式细胞仪上都能正常工作；对于三种颜色，蓝色、绿色和红色荧光蛋白组合（如TagBFP + EGFP + mCherry）或青色、黄色和红色组合（例如CyPet + YPet + mCherry）可以很好的一起配合工作。

荧光蛋白应用于活体成像实验时，尽量选择红色或近红外的荧光蛋白，这类荧光蛋白的发射波长较长，具有更好的组织穿透能力。

• 单体性质

将荧光蛋白与目标蛋白进行融合表达，直接地追踪目标蛋白或是定位目标蛋白，多聚体可能会影响融合蛋白的生物学功能或定位，应尽量选择单体。

• PK值

每个荧光蛋白都有其最合适的 pH 值，即在一定的pH 值下，荧光强度最高。有的荧光蛋白适合在酸性环境下使用，相反有的适合在碱性环境下使用，因此在选择荧光蛋白时需要考虑荧光蛋白的 PK 值。

在细胞内，大多数细胞器内及细胞质的 pH 值都在 7.0 左右，然而溶酶体内的 pH 值就比较低，mCherry的 PK值比较低，可以用于标记溶酶体内的蛋白。

在选择荧光蛋白时，要考虑目标蛋白定位环境的 pH 值，再考虑使用相应 PK 值的荧光蛋白。

• 亮度

荧光蛋白的亮度值由消光系数与量子产率的乘积计算得出。在许多情况下，将荧光蛋白的亮度与EGFP(设定为1)进行比较（见上表），应选择足够亮的荧光蛋白便于检测和成像。

• 光稳定性

荧光蛋白在发光的同时会被漂白，逐渐失去发光能力，因此要想获得更多的信息，就需要荧光的光稳定性好。在普通的荧光成像中，对荧光蛋白的光稳定性要求并不是很高，比如激光共聚焦显微镜成像时，荧光信号的稳定性只需要能保证采集的完整的一张图即可。而在超分辨荧光成像中，对荧光蛋白的光稳定性要求比较高。

• 成熟时间

荧光蛋白在发光之前需要经历转录、翻译、折叠等步骤，其中折叠过程占据了大部分时间，此过程被称之为成熟时间。成熟时间较长的荧光蛋白不适合标记短寿命的蛋白，因为可能目标蛋白开始降解时，荧光蛋白还没有发光，导致无法追踪及定位目标蛋白。因此在选择荧光蛋白时，需要考虑其成熟时间。

• 融合位置

荧光蛋白的融合位置（N 端或C端）主要取决于目的蛋白折叠过程中，荧光蛋白所在的那一端有没有参与蛋白质的折叠。如果标记的目的蛋白是一个新的蛋白，可分别进行N端和C端融合表达，以此来进行选择最后的融合位置。

为什么表达的荧光蛋白亮度较低？

在实际的实验过程中，可能会遇到表达的荧光蛋白亮度很低的情况，除了尽量选择亮度较高的荧光蛋白外，还有可能是以下几种原因导致的：

• 启动子

不同启动子诱导荧光蛋白表达的强弱不同，如UBC启动子只能诱导荧光蛋白的弱表达，可按实验要求选择广谱性或者组织特异性的强启动子，如EF1α、CAG。另外注意有些启动子，如广谱性强启动子CMV在体外细胞中能很好地诱导表达，但在体内实验时则会沉默。

• 表达方式（融合/非融合）

荧光蛋白与目的蛋白的表达方式包括融合表达和非融合表达。融合表达多用于目的蛋白亚细胞定位、蛋白互作探究，但融合蛋白表达的荧光亮度通常低于单独的荧光蛋白，融合表达时，荧光蛋白可能出现错误折叠等现象，导致检测不到荧光信号或荧光较弱。

• 连接原件

非融合表达主要用于检测目的基因表达水平，一般选择连接肽Linker，如2A肽或IRES将ORF分隔开。选择IRES，下游ORF的表达明显弱于上游ORF（约为上游的10%-20%），体内实验尤为明显。选择2A肽，应考虑其切割效率受上下游ORF序列的影响，常选择P2A和T2A，P2A切割效率最高（某些情况高达100％）。

荧光蛋和荧光素酶的区别

荧光素酶(Luciferase)是自然界中能够催化荧光素产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Firey)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶，分别命名为F-Luciferase和R-Luciferase。荧光蛋白和荧光素酶是在基因工程中广泛使用的两个报告基因 (reportergene),除了来源不同之外，他们主要在发光原理、检测方法和用途方面均有不同。

• 发光原理

荧光蛋白例如GFP是用蓝紫光激发即能发出肉眼清晰可见的绿色荧光 , 无需任何底物或辅助因子；而荧光素酶本身不发光，是通过与底物进行化学反应后释放出光子。

• 检测方法

GFP发出的荧光很容易通过紫外灯 、共聚焦显微镜 (confocalmicroscope)、荧光显微镜或荧光激活的细胞分拣器 (fluoresenceactivatedcell sorter, FACS)分析而在活细胞中被检测到。在普通荧光显微镜下 ,以蓝光或紫光激发 ,再选择合适的滤光片 ,就可以看到细胞发出的 GFP荧光 。荧光素酶的活性定量检测通常使用液闪仪或生物发光测定仪 (luminometer)，在标准的反应条件下 ,加入超量的底物 , 在一定的时间间隔内荧光的闪烁总数与同样品中存在的荧光素酶的活性总量成正。另外,也可以采用光自显影法对荧光素酶进行定性检测 。

• 用途

荧光蛋白可与蛋白的N端或C端融合表达而不影响各自功能，可用于观察融合蛋白在细胞内的位置，可以方便地从大量细胞或组织中筛选出来。但荧光蛋白的定量分析仅限于阴性/阳性两个结果，而荧光素酶就能够定量地得到表达量/表达水平的数值，鉴于此，研究者利用荧光素酶开发出一套极其灵敏且使用方便的基因报告系统，被广泛用于转录因子结合位点与启动子活性分析、miRNA与靶基因相互作用分析、活体成像、信号转导等领域。