森贝伽生物：干货来啦~细胞传代注意事项

细胞传代是细胞培养中最基本也是最常见的操作，传代的意义是在于可以帮助我们扩大细胞培养的总数，同时避免细胞在长满培养瓶/皿后开始老化衰败进而死亡的情况。接下来会以“贴壁细胞”为例来进行传代操作详解。

操作准备

相较于细胞复苏冻存，我们细胞传代所需要做的准备工作是最多的，好记性不如烂笔头，我们需要在每一次实验前列好所需的实验器材、实验试剂。需要提前将无菌服、移液枪头、废液缸等实验器材进行高温高压灭菌，并将所需的各类细胞的血清、培养基、胰酶溶液、双抗以及支原体清除剂等确定用量后提前规整放置，保证可以一次性放入传递窗中，避免反复进出细胞房造成污染。

用量确定方法：以单瓶细胞1:3传代为例，每个T25培养瓶所需完全培养基6ml，终止消化反应所需完全培养基6ml，所以总共需要配置24ml完全培养基。

当我们做好以上准备后，我们接下来就可以正式开始我们的传代步骤了。

Operating Steps

操作步骤:

消洗后进入准备间，穿戴好灭菌服、灭菌手套以及口罩等防护用具进入细胞房。

取出需要传代的细胞后进行观察，彼此汇合率超过80%或细胞密度达到约8x10^5cells/ml左右时可以进行传代。

根据不同的细胞特性选取不同的血清、培养基进行完全培养基配置完全培养基，普遍推荐比例为 1%P/S + 10%FBS + 基本培养基 （如担心支原体污染可酌情加入1%支原体清除试剂）。

配置完成后从细胞培养箱中取出需要传代的细胞瓶，消毒操作后用移液枪移去旧的培养液，加入1-2ml PBS缓冲液洗涤2次（加入PBS时需要从无细胞的一面加入，避免冲掉细胞）移除PBS缓冲液。

用移液枪加入2ml胰酶溶液（需在37%水浴锅中预热）轻微晃动使胰酶与细胞完全接触后静置在细胞培养箱中消化15-30s（具体胰酶含量以及消化时间需要视具体细胞情况而定）。

当肉眼观察细胞培养瓶中细胞层呈现磨砂状且有细胞下流或在倒置显微镜下观察细胞变圆润且大量脱落时，准备终止消化。

用移液枪加入等量完全培养基冲洗细胞终止消化，充分吹打细胞保证完全终止并且避免产生气泡。

将细胞悬液转移至离心管内，设置1000r/min速率离心3min。

离心完成后将上清液倒去，加入新的完全培养基吹打混匀细胞（避免产生气泡影响细胞活率）取样观察计算细胞数以及细胞活率，根据数据决定传代比例。

同样以1:3传代为例，加入18ml完全培养基完全混匀后，在每个无菌T25培养瓶中移取6ml细胞悬液分装，显微镜下观察状态后有序放置在37 、5%CO2细胞培养箱中培养。

至此传代完成

细胞传代小贴士TIPS ：

1、全程需严格无菌操作；

2、细胞较脆弱，吹打细胞过程需轻柔；

3、每次移液后需要更换枪头，避免造成溶液交叉污染；

4、胰酶消化时间太久会加速细胞老化，需严格控制消化时间。