连比尔·盖茨都忍不住点赞的基因编辑技术究竟是什么？

新冠突袭的2020年初，比尔·盖茨在AAAS（美国科学促进年会）上提出，“未来，人工智能和基因编辑技术会以指数级的速度发展，我们将有机会构建新一代的健康解决方案。”

图1：基因编辑

巧合的是，这两大技术均于2012年左右爆发，几年之内席卷世界，并将持续产生重要影响。目前，AI被广泛运用于很多生活场景，无人驾驶、人脸识别、各类网站和app的个性化推荐、医学图像处理等。

基因编辑，被《科学》杂志列为 2013 年年度十大科技进展之一，正推动着生命医学研究的革命性发展，而且在药物研发中也有广阔的应用前景。

“上帝之手”基因编辑

如果说生物的全基因序列是一本写满“生命密码”的天书，基因测序技术的快速成熟和普及，让科学家打开了这本书。那么，基因编辑技术，则赐予了他们一支“修改、调整”基因序列的笔。

2012年到2013年初，三篇CRISPR/Cas 9系统进行基因编辑的论文先后发表在顶级科学期刊 Science 上。詹妮弗·杜德纳和艾曼纽，证明了 CRISPR-Cas9系统在体外具备基因编辑的能力。紧随其后，2014年，张锋和乔治·丘奇改进技术，系统操作变得更简洁高效, 成本低廉,开启了CRISPR/Cas 9系统在真核生物（哺乳动物）细胞中广泛运用的先河。

图2：张锋经典论文—CRISPR/Cas9应用于哺乳动物

CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称, Cas是CRISPR 相关蛋白的简称。本质上是在细菌和古细菌中发现的一种为抵御病毒和质粒的不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。相较于ZFN和TALEN 采用蛋白质作为靶标识别物, CRISPR/ Cas9 用sgRNA (small guide RNA) 靶向目标基因, 是基因功能研究领域强有力的武器。

gRNA是向导RNA—系统的GPS导航工具，它能识别“出错”的位置。Cas9 是一种核酸内切酶，它会抵达“事发地”剪掉错误的基因片段。CRISPR/Cas9也常被业内称为“魔剪”和“上帝之手”。当 Cas9 对靶标 DNA 进行切割时, 会造成 DNA双链断裂 (double strand break, DSB), 随即细胞启动DNA 修复机制。

图3：基因魔剪与上帝之手

在非同源末端连接修复机制下能够形成随机的多个碱基插入或缺失, 使编码蛋白的基因发生移码和错义等严重突变, 阻碍蛋白行使正常功能; 而在同源重组修复机制下则可以实现精确的基因敲入遗传修饰, 如点突变、插入和表位标记等。因此, 通过这两种修复机制, CRISPR/Cas9 技术即可按照需要，实现基因敲除和基因敲入的基因组改造。

图4：CRISPR/Cas9基因编辑系统技术原理图

CRISPR/Cas9技术主要包含引物设计、sgRNA表达质粒的构建、靶细胞转染、混合 pool 的筛选与鉴定和单克隆的分离与验证几大步骤, 大致流程如图。

图5：CRISPR/Cas9基因编辑系统技术流程图

诚如诺贝尔颁奖词所言，“CRISPR/Cas9彻底改变了分子生命科学，可能使治愈遗传学疾病这一人类梦想美梦成真。”

CRISPR/Cas9基因编辑系统最重要的特征之一是它具有可编程性（reprogrammable）。只要给它一个指导RNA，就能够与特定的DNA序列结合来行使后续功能，例如启动或者关闭基因，对DNA进行编辑。还可以使基因片段从一个物种转移到另一个物种成为可能。例如，几年前，曾经有研究将来自深海一种鱼类的防冻基因插入到草莓基因组中，并成功培植出防寒草莓。

部分疾病的出现就是基因片段出现了错误，有了CRISPR/Cas9技术的修正，便能达到疾病治愈的目的。比如β-地中海贫血患者，目前患者主要是两种治疗方式：终生输血，血源有限、极少能接受规范治疗；造血干细胞移植治疗，花费巨大、配型极难，科学家对病人的造血干细胞进行基因编辑，引入HPFH良性突变，使患者重新生成胎儿血红蛋白。也有科学家利用基因编辑技术重新开启胎儿期的γ珠蛋白的表达，替代有缺陷的β珠蛋白（打开婴儿出生后被关闭的γ基因）。目前这样的基因治疗方法已让5名重症地贫患儿治愈，有望实现“一次治疗终身治愈”的疗效，成为β-地中海贫血患者新的治疗方法。

基因编辑在药物研发中的作用

图6：CRISPR/Cas9辅助药物研发

功能基因的筛选

基于CRISPR技术的高通量筛选系统可以用于大规模地敲除（CRISPR-KO）、抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa）大量候选基因。

图7：CRISPR-Cas在构建细胞模型和大规模筛选中的应用

基于基因编辑技术的基因缺失性或获得性功能研究（如基因敲除或基因敲入细胞系）可用于确定潜在药物靶点和疾病的关联性。通过观察疾病表型的恶化或是缓解，可以找到潜在的药物作用靶点。

一旦确定了一个潜在的药物作用靶点，需要进一步收集体外实验和体内实验的功能验证数据。此阶段可以通过CRISPR技术构建基因敲除细胞系模型和基因激活（过表达）细胞系模型来加速这一进程。如果一个靶点和疾病之间的因果关系已经确定，并且该靶点具有药物开发潜能，那么接下来就可以启动高通量的化合物筛选实验，寻找潜在的治疗候选药物。

汇像的高通量细胞株自动化筛选，助力基因编辑筛选

高通量化合物筛选

上周的高通量筛选讲的是从分子水平的检测方法AI制药超级实验室 高通量筛选技术，而基于细胞系筛选的功能关联性分析，就可以利用基因编辑技术。

比如，荧光素酶 (luciferase) 报告基因系统是一种以荧光素 (luciferin) 为底物来检测荧光素酶活性的报告系统。荧光素酶可以催化底物荧光素形成氧化荧光素，在这个过程中会发出生物荧光 (Gould and Subramani, 1988)。该系统具有灵敏度高，读数结果稳定等优点。

欲筛选能够抑制靶蛋白A表达水平的活性小分子，而靶蛋白A表达水平很低，敲入荧光蛋白EGFP后，未能检测到荧光。因而引入荧光素酶报告基因系统，利用CRISPR/Cas 9技术将荧光素酶编码序列插入到神经母细胞瘤细胞系 (SH-SY5Y) 靶蛋白A编码基因的3’端。构建好的敲入细胞系将表达靶蛋白A与荧光素酶的融合蛋白。敲入细胞系经过活性小分子处理后，加入含荧光素的裂解液，检测荧光值 (luminescence) 即可判断该小分子对靶蛋白A表达水平的影响。

先导化合物验证

构建细胞系模型和动物模型，评估先导化合物有效性和安全性，大大加快了先导化合物验证的进程。

图8：CRISPR-Cas在体内筛选和动物模型构建中的应用

最新科研进展

基因编辑系统技术给生物医学研究领域带来了许多惊喜，但也有相应的缺陷，比如递送难、脱靶效应等。所以自基因编辑系统技术问世以来，全球的科学家都在努力对它进行优化。

递送难

基因编辑系统的递送系统，目前已开发了AAV载体、LNP等，它直接决定了改变DNA或者RNA的工具能否安全有效地递送到正确细胞，但只能实现小片段的基因编辑。

在2021年，张锋团队连续发文，先在细菌中发现了IscB的蛋白（400个氨基酸），个头小，这些蛋白具备核酸酶的活性，而且也能够依靠RNA指导对特定双链DNA进行切割，与Cas9（800-1200个氨基酸）相比个头小很多，更容易递送到体内且保留了可编程特征，有望实现大型基因组改造。

图9：Cas13蛋白的发现

接着找到了新的递送方式。全身性递送系统通常会将“货物”先递送到肝脏，如果最终目标是靶向其它组织，目前的疗法可能先会在肝脏中被吸收，导致出现肝脏毒性。因此需要开发靶向其它组织或者能够局部递送的基因疗法递送系统。PEG10的蛋白能够包装mRNA并且将它们递送到其它细胞中，可递送更大型的基因、显著降低人体的免疫反应，有望提供一种更安全、可重复给药的递送方案。

不可预测性

另一大问题是脱靶效应带来编辑结果的不可预测性，这项技术变得有安全隐患，当编辑其中一个基因，很难预测它会如何影响其他基因的表达。

比如CCR5 基因缺失的个体，对艾滋病病毒是免疫的。但敲除CCR5 基因之后，个体感染西尼罗病毒 (West Nile V irus, WNV) 的风险明显比正常人高很多。假如所有人CCR5 基因敲除，那么当这个病毒流感爆发时，事态将一发不可收拾。

要解决这个问题，张锋对此的看法是，“AI可以帮助我们拿到更多生物学的数据，不仅是基因序列，还包括它们直接的互相作用，因此能帮助我们预测编辑一个基因后，其他的基因水平将会如何变化。”

未来，在药物研发中，AI和基因编辑技术也许能更好地组成组合拳，让基因编辑技术变得更安全、稳健、便捷高效。