知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质及糖尿病的整合机制研究

文章来源:温丽娜,贾平平,石汉平.知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质及糖尿病的整合机制研究.中药新药与临床药理,2022,6(33): 804-812.

正 文

肿瘤恶液质是一种以持续性骨骼肌丢失为特征、不能被常规营养支持治疗完全缓解、进行性功能损伤的多因素综合征[1]。糖尿病是肿瘤人群常见的一种合并症。糖尿病作为临床高发的以高血糖或尿糖为特征的代谢性疾病，与肿瘤恶液质密切相关[2]。中医学认为肿瘤恶液质属于“虚劳”范畴，主要病机为气血阴阳虚衰，久虚不复成劳，治疗以补益为基本原则，扶正解毒[3]。糖尿病则属于“消渴”范畴，阴虚燥热为基本病机，一般以清热润燥、养阴生津为治疗大法，依据具体证候还可施以益气、燥湿、化瘀等治法[4]。“异病同治”是中医治疗的法则之一，即具有相同病机的不同疾病可以使用相同的治疗方法。肿瘤恶液质及糖尿病具有“阴虚”的共同病机，为二者的“异病同治”奠定了基础。知母-黄柏药对出自金元四大家之一李杲的代表著作《兰室秘藏》[5]。方中知母清热泻火、滋阴润燥，黄柏清热燥湿、泻火坚阴。二者配伍，相辅相成，增强了清热润燥、养阴泻火的功效。中医学用其治疗阴虚燥热相关病证，如消渴病等。基础研究表明，知母-黄柏药对除具有降糖药理作用[6]外，还可逆转肿瘤恶液质小鼠及糖尿病小鼠的肌肉萎缩，缓解肿瘤恶液质，其分子机制为知母-黄柏药对调节了Akt/mTOR/FoxO3信号通路、IGF-1/Akt信号通路及自噬[7-8]，但其“异病同治”阴虚所致的肿瘤恶液质及糖尿病的分子机制尚未明确。由此，本研究依托网络药理学和分子对接技术，探究知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质及糖尿病的整合分子机制，以期为二者的治疗及药物研发提供新视角，对于肿瘤防治的整合策略具有一定的参考意义。

1 材料与方法

1.1 数据库及可视化分析软件 （1）有效成分及靶点数据库 TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、Similarity ensemble approach（http：//sea.bkslab.org/）、SwissTarget Prediction（http：//swisstargetprediction.ch/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）；（2）化学结构数据库 PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；（3）蛋白质相互作用及功能数据库 Uniprot（https：//www.uniprot.org/）、STRING（https：//string- db.org）、 Metascape（https：//metascape.org/）、 DAVID （https：//david.ncifcrf.gov/）、 KOBAS（https：//david.ncifcrf.gov/）、Reactome（https：//reactome.org/）；（4）蛋白质结构数据库 RCSB Protein Data Base（https：//www.rcsb.org/）；（5）作图软件 Cytoscape 3.6.0、微生信作图工具（http：//www.bioinformatics.com.cn/）、PyMOL2.1、Autodock tool 1.5.6。

1.2 知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质和糖尿病的作用靶点及药对-成分-靶点网络的构建 在中药系统药理学分析数据库TCMSP中依次检索知母、黄柏，以口服生物利用度（OB） 30%，类药性（DL） 0.18为标准筛选各自的潜在生物活性成分。获取筛选出的成分在TCMSP中的作用靶点。借助PubChem数据库下载每个潜在生物活性成分结构的SDF文件，分别于Similarity ensemble approach及SwissTarget Prediction数据库中获取Max Tc 0.5及Probability 0.5的作用靶点。整合3个数据库人源的作用靶点，借助蛋白质数据库Uniprot进行靶点标准化，建立知母-黄柏药对作用靶点的数据集。在人类基因数据库GeneCards和疾病相关基因与突变位点数据库DisGeNET中分别检索肿瘤恶液质及糖尿病的靶点，纳入GeneCards中Relevance score 10及DisGeNET中Score_gda 0.5的靶点。通过韦恩图获取知母-黄柏药对作用靶点与肿瘤恶液质及糖尿病疾病靶点数据集的交集，作为知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质和糖尿病的作用靶点。采用Cytoscape 3.6.0软件构建药对-成分-靶点网络。借助Network Analyzer插件进行网络拓扑分析，依据节点度值、介数中心性等参数筛选关键生物活性成分。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建及关键靶点筛选 将知母-黄柏药对同时治疗肿瘤恶液质及糖尿病的靶点输入蛋白质相互作用STRING 11.0平台，相关性评分设置为最高（0.9），构建PPI网络。将PPI网络数据输入Cytoscape 3.6.0软件，借助Network Analyzer插件进行网络拓扑分析，依据节点度值、介数中心性等参数筛选关键靶点。采用基因功能注释分析工具Metascape进行PPI MCODE组件分析。

1.4 知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质和糖尿病作用靶点的GO及KEGG富集分析分别采用DAVID和KOBAS平台进行知母-黄柏药对治疗肿瘤恶液质及糖尿病的作用靶点的基因本体（GO）和京东基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，取false discovery rate（FDR）和Corrected-P 0.05的结果纳入研究。GO的生物学过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）按照FDR从小到大排列前10条及去掉显著不相关通路后的KEGG信号通路按照Corrected-P值从小到大排列前30条分别用微生信作图工具进行可视化。

1.5 信号通路的全基因组概况分析 借助Reactome数据库进行作用靶点的反应组信号通路分析，以揭示知母-黄柏药对治疗肿瘤恶液质及糖尿病的相关信号通路的全基因组概况。

1.6 分子对接分析 选取PPI网络中前10个重要靶点与药对-成分-靶点网络中前10个重要生物活性成分分别进行分子对接。借助RCSB Protein Data Base数据库获取靶点的PDB结构文件。借助PubChem数据库获取生物活性成分的SDF文件，经过PyMOL及Autodock tool 1.5.6处理后，采用Autodock vina进行分子对接，选择结合自由能最低的构象进行分析，并通过PyMOL进行可视化。

2 结果

2.1 知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质和糖尿病的活性成分及靶点网络 检索到符合筛选标准的知母的成分15种，黄柏的成分37种，知母、黄柏共有成分1种（豆甾醇），知母-黄柏药对的生物活性成分总计51种。检索到知母的作用靶点223个，黄柏的作用靶点320个，去重后，知母-黄柏药对的作用靶点总计382个。检索到符合筛选标准的肿瘤恶液质的疾病靶点573个，糖尿病（包括Ⅰ型和Ⅱ糖尿病）的疾病靶点1040个，纳入后续研究。将肿瘤恶液质、糖尿的疾病靶点及知母-黄柏药对的作用靶点数据集通过韦恩图取交集后，获得知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质和糖尿病的作用靶点63个，见图1。通过药物分别或共同治疗肿瘤恶液质及糖尿病的作用靶点占药物全部作用靶点的比重分析可知，知母黄柏配伍前后治疗不同疾病的作用靶点的比重略有变化，如表1所示。由此产生的生物学效应有待于进一步研究。构建知母-黄柏药对51个潜在生物活性成分和“异病同治”肿瘤恶液质及糖尿病的63个作用靶点的药对-成分-靶点网络，如图2所示。该网络中存在116个节点及248条边。节点代表靶点，边代表节点之间的相互作用程度。度值代表节点在网络中充当媒介的次数，度值越大说明此靶点越重要。通过网络拓扑分析，筛选度值位居前10位的生物活性成分，作为知母-黄柏药对的重要生物活性成分，其具体信息如表2所示。

2.2 知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质及糖尿病的PPI网络及关键靶点 构建的PPI网络如图3-A所示。该网络包含60个节点和258条边。依据拓扑分析，度值、介数中心性上述参数排在前10位的靶点的具体信息如表3所示。PPI网络中可见，知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质和糖尿病的最重要的5个靶点分别为α-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、转录因子AP-1（JUN）和白细胞介素6（IL-6）。通过Metascape平台获得的PPI网络的聚类分析模块如图3-B所示。相对而言，模块1与肿瘤、模块2与炎症、模块3与内分泌及血管生成、模块4与低氧密切相关。

2.3 GO和KEGG通路富集分析 GO富集分析获得的FDR值位居前10位的BP、CC、MF如图4-A所示。知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质和糖尿病的作用靶点主要通过RNA聚合酶II启动子起始转录的正调控等生物过程，基于细胞外间隙等细胞组分，发挥调节细胞因子活性等分子功能。KEGG信号通路富集分析获得的前30条信号通路如图4-B所示，主要涉及：①与肿瘤相关的通路，如癌症通路；②与糖尿病相关的通路，如胰岛素通路；③与免疫炎症相关的通路，如Th1和Th2细胞分化信号通路；④与骨骼肌质量和功能相关的通路，如Akt、mTOR、FoxO和AMPK信号通路；⑤与脂肪相关的通路，如脂肪细胞脂解的调节；⑥与代谢相关的通路，如癌症的胆碱代谢；⑦与内分泌相关的通路，如内分泌抵抗通路；⑧与血管生成相关的通路，如HIF1信号通路；⑨与细胞生物学相关的通路，如细胞衰老等。

2.4 信号通路的全基因组概况 Reactome生物反应过程通路分析结果提示免疫系统通路在筛选出的靶点中过度表达的程度最高，其次为信号转导通路，如图5所示。全基因组概况分析的前30条可能性最大的信号通路如图6所示，其中可能性位居前5位的通路均为免疫系统相关信号通路。

2.5 分子对接结果 10种最重要的潜在生物活性成分与10个关键作用靶点的分子对接能量如图7所示。结果提示最低能量为-10.8kcal·mol-1，最高能量为-4.4kcal·mol-1，说明所选生物活性成分与作用靶点均能够结合，且大部分对接能量 -5kcal·mol-1，说明大部分重要生物活性成分与关键作用靶点均具有较好的结合潜能。每一个作用靶点与其结合能力最强的生物活性成分的对接模式如图8所示。

3 讨论

肿瘤恶液质通常合并多种疾病，其中糖尿病与肿瘤恶液质的关系极为密切[9]。现代医学研究[10]表明肿瘤恶液质的发病机制与蛋白质、脂类、糖类等营养物质代谢异常及炎症反应有关，但是尚未十分明确。糖尿病的发病机制则由免疫、炎症、代谢介导[11]。可见除了共同的中医学病机——阴虚，肿瘤恶液质与糖尿病还具有共同的现代医学发病机制——炎症反应及代谢异常。此外，机体胰岛素的敏感性降低，器官对葡萄糖的摄取减少，导致骨骼肌和脂肪组织丢失，促进了肿瘤恶液质的发生发展；而恶液质机体肿瘤细胞释放的乳酸和炎症因子又有助于增加葡萄糖的产生和能量消耗，诱发胰岛素抵抗，加速糖尿病的进程[2]。因此，同时治疗肿瘤恶液质和糖尿病的策略，有可能为肿瘤恶液质的治疗提供新方向，对于肿瘤疾病的整合治疗具有重要意义。免疫系统在肿瘤相关疾病中发挥了重要的调节作用。作为细胞免疫调节的关键因子，T细胞参与调节肿瘤恶液质及糖尿病的发展过程[12-13]。辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（CTL）可能增强骨骼肌早期损伤反应，而调节性T细胞（Tregs）则释放抗炎细胞因子IL-10以调节M1到M2样MΦ表型的转换，主要在骨骼肌修复和重塑后期发挥作用[14]。表达最低密度细胞表面标志物CD44的CD4+T细胞可以改善肿瘤恶液质的淋巴细胞减少和肌肉质量丢失[15]。美国糖尿病协会定义的Ⅰ型糖尿病为自身免疫性胰岛细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏，Ⅱ型糖尿病为胰岛素抵抗情况下胰岛素进行性分泌不足[16]。通常认为Ⅰ型糖尿病是由免疫机制介导的，而Ⅱ型糖尿病则由炎症和代谢机制介导[11]。Treg和Th17细胞之间的平衡可能是治疗Ⅰ型糖尿病的一个靶点[17]。对于Ⅱ型糖尿病，影响胰岛素信号通路的巨噬细胞信号使适应性免疫室极化从而维持慢性Th1/17或Th2的反应，而Tregs细胞亚群则可以通过Th2极化产生IL-4、IL-5和IL-13等调节或重塑性细胞因子进而调节免疫[18]。可见，免疫调节治疗有望成为肿瘤恶液质和糖尿病整合治疗的有效手段。中药药对既符合复方配伍的基本规律，又有利于最大限度地发挥单味药的优势作用，具有一定的临床应用价值和应用前景。本研究依托网络药理学，通过靶点分类统计及药对-成分-靶点网络分析揭示了知母、黄柏配伍前后作用重心的变化及知母-黄柏药对的重要生物活性成分。结果表明无论是单用还是合用，知母、黄柏的降糖靶点比例都高于治疗肿瘤恶液质的靶点。配伍后，降糖及同时治疗肿瘤恶液质和糖尿病的作用靶点的比例均有所减少，说明知母、黄柏配伍后可能产生了更多其它作用，这是否是知母、黄柏配伍增效的机制，有待于进一步深入研究。在筛选出的10种重要生物活性成分中，临床前研究证实小檗碱可通过调节IL-6而有效缓解肿瘤恶液质[19]，并通过降低IL-6水平等多种分子机制发挥降糖作用[20]；同时，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等成分也具有抗癌和降糖作用[21-26]。分子对接结果表明主要生物活性成分与主要作用靶点均具有结合潜能，且大部分具有较高的结合活性，这可能是知母-黄柏药对已被证实可以逆转肿瘤恶液质及糖尿病动物模型肌肉萎缩的物质基础。本研究筛选出AKT1、VEGFA、MAPK1、JUN、IL-6等10个关键靶点，其中JUN、EP300及TP53同时作为转录因子，与肿瘤、糖尿病、免疫炎症密切相关。PPI聚类分析及“异病同治”的靶点富集到的KEGG代谢通路涵盖了肿瘤、糖尿病、免疫炎症、代谢、骨骼肌质量及功能、血管生成、细胞生物学效应等多种疾病和生物过程，提示肿瘤恶液质及糖尿病的发生、发展不局限于单一靶点、单一生理功能或单一生物过程的改变和调控。例如，作为肿瘤恶液质的重要特征，骨骼肌质量减少和功能丧失可以看作是骨骼肌对肿瘤恶液质导致的机体内环境发生的改变做出的一种反应[27]。与骨骼肌质量及功能相关的涉及Akt、mTORC1、FOXO3A和AMPK等信号通路的细胞内调节网络易被癌症或化疗所破坏，使相关信号通路对生长因子、机械刺激、营养素、细胞能量水平和炎症等作出异常反应，引发相关病理变化[28-29]。因此，知母-黄柏药对对肿瘤恶液质及糖尿病的调节是一种基于多条信号通路的整合分子网络调节。骨骼肌相关细胞内调节网络涉及的通路皆可能是知母-黄柏药对治疗肿瘤恶液质小鼠和糖尿病小鼠肌肉萎缩的作用靶点。网络药理学研究表明知母-黄柏药对“异病同治”肿瘤恶液质及糖尿病的分子机制是调节了与二者相关的多种疾病和生物反应过程的整合分子功能网络。从全基因组层面分析，免疫系统调节是知母-黄柏药对发挥“异病同治”肿瘤恶液质及糖尿病作用的主要反应过程。炎症反应是肿瘤恶液质及糖尿病的共同发病机制，与免疫调节密不可分。药物通过免疫调节发挥“异病同治”肿瘤恶液质及糖尿病的作用在理论上具有可行性。既往研究表明知母-黄柏药对的有效成分小檗碱可以直接抑制促炎性 Th1和Th17细胞的功能和分化，并通过调节或抑制Tregs、树突细胞和巨噬细胞等间接减轻Th细胞介导的炎症，可以通过Toll样受体等调节免疫预防癌症，可以通过调节肠屏障完整性与免疫耐受发挥降糖作用[30-32]。本研究富集到的白介素信号通路、IL-4和IL-13信号通路等生物反应过程通路，免疫系统信号通路也说明了免疫调节可能为知母-黄柏药对同时治疗肿瘤恶液质和糖尿病的新机制，有待于通过实验研究进一步验证。