微生物酶制剂生产

菌种选择
    任何生物都能在一定的条件下合成某些酶。但并不是所有的细胞都能用于酶的发酵生产。一般说来，能用于酶发酵生产的细胞必须具备如下几个条件：酶的产量高。优良的产酶细胞首先具有高产的特性，才有较好的开发应用价值。高产细胞可以通过筛选、诱变、或采用基因工程、细胞工程等技术而获得；容易培养和管理，要求产酶细胞容易生长繁殖，并且适应性较强，易于控制，便于管理；产酶稳定性好。在通常的生产条件下，能够稳定地用于生产，不易退化。一旦细胞退化，要经过复壮处理，使其恢复产酶性能；利于酶的分离纯化。发酵完成后，需经分离纯化过程，才能得到所需的酶，这就要求产酶细胞本身及其它杂质易于和酶分离；安全可靠。要使用的细胞及其代谢物安全无毒，不会影响生产人员和环境，也不会对酶的应用产生其它不良的影响。

产酶培养
    酶的发酵生产是以获得大量所需的酶为目的。为此，除了选择性能优良的产酶细胞以外，还必须满足细胞生长、繁殖和发酵产酶的各种工艺条件，并要根据发酵过程的变化进行优化控制。
1)  固体培养法
     固体培养是以皮麸或米糠为主要原料，另外添加谷糠、豆饼等为辅助原料。经过对原料发酵前处理，在一定的培养条件下微生物进行生长繁殖代谢产酶。固体培养法比液体培养法产酶量高。同时还具有原料简单、不易污染、操作简便、酶提取容易、节省能源等优点。缺点是不便自动化和连续化作业，占地多、劳动强度大、生产周期长。
2) 液体培养法
    液体培养法的优点是：占地少、生产量大、适合机械化作业、发酵条件容易控制、不易污染，还可大大减轻劳动强度。其培养方法有分批培养、流加培养和连续培养三种，其中前两种培养法广为应用，后者因污染和变异等关键性技术问题尚未解决，应用受到限制。在深层液体培养中，pH值、通气量、温度、基质组成、生长速率、生长期及代谢产物等都对酶的形成和产量有影响，要严加控制。深层培养的时间通过监测培养过程的酶活来确定，一般较固体培养周期(1~7d)短，仅需1~5d。与固体培养法相比，
3)  产酶条件的控制
    提高微生物酶活性和产率的途径是多方面的，其中控制营养和培养条件是最基本也是最重要的途径。改变培养基成分，常常能提高酶活性，改变培养基的氢离子浓度和通气等条件，可以调节酶系的比例，改变代谢调节或遗传型，可以使酶的微生物合成产生成千倍的变化。上述的这些措施，对于微生物产酶的影响并非孤立的，而是相互联系、相互制约的。所谓最佳培养条件与培养基的最佳组成，都是保证酶合成达到最高产率的控制条件。通常，菌种的生长与产酶未必是同步的，产酶量也并不是完全与微生物生长旺盛程度成正比。为了使菌体最大限度地产酶，除了根据菌种特性或生产条件选择恰当的产酶培养基外，还应当为菌种在各个生理时期创造不同的培养条件。例如细菌淀粉酶生产采取"低浓度发酵，高浓度补料"，蛋白酶生产采取"提高前期培养温度"等不同措施，提高了产酶水平。
①  培养基
a  碳源
碳水化合物是微生物细胞的重要组成材料、能源和酶的组成部分，也是多种诱导酶的诱导物。不同微生物要求的碳源不同，是由菌种自身的酶系（组成酶或诱导酶）所决定。
综合起来有如下几点值得注意：葡萄糖、蔗糖等易利用的碳水化合物，对促进细胞的呼吸与生长有利。高浓度下，对产酶有抑制作用，如蛋白酶和α-淀粉酶等就是如此，也有与此相反的情况；有些微生物不能利用复杂的碳水化合物，必须使用葡萄糖等简单的碳水化合物时，可采用流加法等避免出现"葡萄糖效应"现象；有时近似的碳源，也会因某些原因，出现不同的产酶情况，如黄青霉（葡萄糖氧化酶产生菌）在甜菜糖蜜作碳源时不产酶，以甘蔗糖蜜作碳源时产酶量显著增高。此外，碳源类型除了影响产酶外，还能影响微生物胞内酶与胞外酶的比例。
    有些碳源本身就是酶的诱导物，如短乳杆菌（葡萄糖异构酶产生菌）必须在木糖培养基上产酶，以葡萄糖作碳源时，尽管菌体繁殖旺盛却不产酶。当然也有不需木糖作诱导物的葡萄糖导构酶产生菌。至于α-淀粉酶生产培养基中加入淀粉，果胶酶生产时加入果胶或含果胶物质的甜菜渣和水果渣，这都是早为人所共知的诱导物。但是不以底物作诱导物的情况也很多，如以果糖代替果胶，却能使果胶酶活性提高二倍。乳糖不仅诱导果胶酶，也能诱导绿色木霉增加纤维素酶的产量。
    诱导方法有： 直接诱导法，即将诱导剂直接加入培养基中，使之发酵产酶；两步培养诱导法，先将微生物接种在不含诱导剂的培养液中，繁殖大量菌丝。在产酶期，把菌体转入含诱导剂的培养液中，使之大量合成酶。两步法提高产酶的原因，可能是这种方法可以避免分解代谢物阻遏，使诱导物能充分发挥其诱导作用；二次诱导法，如焦曲霉在乳糖做碳源时，能产生少量a-半乳糖苷酶，焦曲霉也能在棉子糖诱导下合成α-半乳糖苷酶。若在培养液中先加少量棉子糖，使之起预诱导作用，然后在菌体进入大量合成酶的生长时期，再加入适量的乳糖，进行二次再诱导，可能合成较多的a-半乳糖苷酶。
b 氮源
    氮源是蛋白质的组成成分，氯源的不同，也能起到诱导和阻遏酶形成的作用。在蛋白酶生产中，蛋白质能诱导酶的形成，而它的水解物就不及它本身好。氨基酸的作用变化很大，有的有利，有的抑制。
    氮源对于微生物生长与产酶有几方面影响：既促进微生物生长，又促进产酶；只促进微生物生长，不促进产酶；只促进产酶，不促进微生物生长；既不促进微生物生长，又不促进产酶。
    在严格选定氮源类型之后，还应当注意碳源浓度，即碳氮比、无机氮与有机氮的浓度比例、无机氮的种类等。在曲霉淀粉酶的生产过程中，如果碳源不足，不能得到充分的能源，菌丝体对于氮源的消耗显著降低，影响淀粉酶的合成。枯草杆菌产生果聚糖蔗糖酶时，培养基中蔗糖浓度10%，铵盐[如(NH4)SO4]浓度必须超过菌体生长的最高需要量（即达到含氮量0。15%左右），酶的产量才大幅度上升。
c  无机盐
有些金属离子本身就是酶的组成部分。盐对产酶的效应比较复杂，现分述如下：
    磷：多数情况对产酶有促进作用，在蛋白酶中比较明显；
    钙：Ca2+对蛋白酶有明显的保护和稳定作用。如无Ca2+存在时，灰色链霉菌中性蛋白酶只在PH7~7.5很狭范围内稳定，当有Ca2+存在时，稳定pH范围扩大到5~9，在Ca2+存在下，枯草杆菌中性蛋白酶在pH5.5~10可以稳定数小时，其反应最适温度可以提高到57 。一种真菌产生的碱性蛋白酶，在Ca2+存在时，37 时的半衰期由7.5min延长到165min。有Ca2+时半数以上碱性蛋白酶可在65 维持15min。50 培养的耐热蛋白酶，在Ca2+存在下80 加热10min、酶活尚存85%，无Ca2+时76 经10min，酶活即下降50%。Ca2+对α-淀粉酶的作用更为明显，纯化的α-淀粉酶在50 以上容易失活，但有大Ca2+存在时，酶的热稳性增加。不同的菌种热稳性提高到65 至90 。 PH的稳定范围也从5~7扩展至5~11。α-淀粉酶是一种金属酶，每分子酶含1克原子Ca2+，Ca2+使酶分子保持适当的构象，从而维持最大的活性与稳定性。不同菌种热稳定性的不同是由于高温对Ca2+的亲和力不同所致。α-淀粉酶与Ca2+的结合不因EDTA的处理而失活，除非pH低于3，但若添加与EDTA相当量的Ca2+，并将其复至中性，仍可恢复活性。
    Na+、Cl-对提高枯草杆菌液化型a-淀粉酶的耐热性的作用尤为显著。
    添加适量的Mg2+，Zn2+，Mn2+，Co2+，Fe2+等能提高蛋白酶和α-淀粉酶等的产酶量。D-木糖异构酶需要二价金属离子才有活力，不同菌种需As2+，Mg2+，Mn2+和Co2+等，在一种情况下，一种离子可能是活化剂，在另一种情况下却成了抑制剂。不同的酶往往需要不同的离子作它的活化剂。
    一般说金属和重金属离子如Hg2+，Ag2+，Pb2+，Zn2+，Ni2+，Cu2+，A13+及有些情况下的Ca2+，Fe2+等对酶活力有抑制。若有适当浓度的Mg2+，Co2+共存时，则可显著减轻有害离子的抑制作用。
d  生长因素
多种氨基酸维生素是微生物生长与产酶的必要成分，有些维生素甚至就是酶的组成部分。麦芽根、酵母膏、玉米浆、米糠、曲汁、麦芽汁、玉米废醪中均含有不同程度的微量生长因素，对促进产酶有显著效应。磷酸酰环己六醇也是微生物的重要生长因素之一。
2)  培养条件
① pH值
    同一菌种产酶的类型与酶系组成可以随pH值的改变而产生不同程度的变化。如用黑曲霉使腺苷酸氧化脱氨转变为肌苷酸时，培养在pH值6.0以上的环境中，果胶酶活性受到抑制，pH值改变到6.0以下就形成果胶酶。pH值还决定酶系的组成，泡盛曲霉突变株在pH值6.0培养时，以产生a-淀粉酶为主，糖化型淀粉酶与麦穿糖酶产生极少。在pH值2.4条件下培养，转向糖化型淀粉酶与麦穿糖酶的合成，α-淀粉酶的合成受到抑制。
    在蛋白酶生产中，pH低有利于酸性蛋白酶生成，pH高有利于中性和碱性蛋白酶生成，这是相一致的。产酶pH值常同酶反应最适pH值接近，但酶反应的最适pH也许对某些酶最不稳定，在这种场合下只能选择尽量靠近的pH值。
    在有些情况下，由于pH不同，出现胞内和胞外酶的产量比例不同，如α-半乳糖苷酶在PH4.8至6.0范围内，其胞内酶占74%。当pH升高时胞外酶的比例就升高。
②  温度
    温度对产酶的影响有以下几种情况：
    产酶温度低于生长温度。酱油曲霉蛋白酶合成的适宜温度在28 ，比生长温度40 条件下产酶量高出2~4倍。在异淀粉酶生产中也有这种情况；
    产酶温度与生长温度一致。如链霉菌合成葡萄糖异构酶约在30 ；
    产酶温度高于生长温度。例如产生糖化型淀粉酶的适宜温度在35 ，而它生长的最适温度为30 。链霉菌产生淀粉酶的温度以35 合适，而生长温度则以28 最好；
    此外，温度还能影响酶系组成及酶的特性。例如，用米曲霉制曲时，温度控制在低限，有利于蛋白酶合成，而α-淀粉酶活性受到抑制。
③  通气和搅拌
    以枯草杆菌产生α-淀粉酶为例。将细菌的生理时期划分为三个阶段：菌体繁殖期，接种后5~13h；
芽胞产生期；产酶期。这三个阶段对于供氧要求是不同的。如果第二时期维持缺氧状态，有助于抑制芽胞形成，第一和第三生理时期充分供氧，可以促进菌体繁殖并提高产酶量，证明不同时期，对通气量要求不同。
对于产异淀粉酶的气杆菌，不同的通气量和培养方式，酶活亦有很大差别。产异淀粉酶的气杆菌，生长期间要求有较大的通气量，而产酶期间通气量以小为好；就生长而论，通气量以中等程度较好。也有与此相反的情况，如蛋白深层发酵时，较小通气量有利于生长，不利于产酶，较大通风量可促进酶的合成而对生长则抑制。但异构酶产生菌因菌种不同，有的在强通风下产酶，有的需弱通风下产酶。
④  种龄
    过老或过嫩，不但延长发酵周期，而且会降低产酶量。一般种龄在30至45h的酶活性最高。

分离提纯
    微生物酶的提取方法，因酶的结合状态与稳定性的不同，应用部门对产品的纯度要求不同，而有一定的区别。如果提取到的酶是一种可溶于水的复杂混合物，则需要进一步加以纯化。适用于大生产的提纯方法总是以降低成本、提高效能而同时又提高产品纯度和质量为前提，事先应当经小试验规模充分对比，从中加以选择。理想的提纯方法应满足二个条件，即比活性的提高与总活性的回收高，但实际上往往难以兼得。
1)  盐析法
    盐析剂中性盐的选择： MgS04，(NH4)2S04，Na2SO4，NaH2P04是常用的盐析用中性盐。其盐析蛋白质的能力随蛋白质的种类而不同，但一般说来这种能力按上述顺序依次增大。一般可以说含有多价阴离子的中性盐其盐析效果好。但实际上(NH4)2S04是最多用的盐析剂，这是因为它的溶解度在较低温度下也是相当高的。有的酶只有在低温下稳定，而低温下Na2S04，NaH2P04的溶解度很低，常常不能达到使这种酶盐析的浓度。
    盐析剂用量的决定：不同的酶使之盐析沉淀的盐析剂用量是不同的，随共存的杂质的种类和数量而有所差异。因此适当的使用量只能根据实践决定，并根据数据可以绘制出盐析曲线。
    pH和温度的影响：蛋白质的溶解度在无盐存在下，以在等电点时为最小，在稀盐状态时大致也是这样。但在高浓度的中性盐溶液中，原有蛋臼质溶液pH的影响不大。实际上溶液最终的pH为盐析剂所决定。
    在无盐或稀盐溶液中，温度低，蛋白质的溶解度也低，但在高浓度盐溶液中，温度高则蛋白质的溶解度反而低。因此一般说来盐析时不要降低温度，除非这种酶不耐热。
盐析法的优点是在常温沉淀过程中不会造成酶的失活，沉淀物在室温下长时间放置也不会失活，在沉淀酶的同时夹带沉淀的非蛋白质杂质少，而且适用于任何酶的沉淀。它的缺点是沉淀物中含有大量的盐析剂。如用硫酸按一次沉淀法制取的酶制剂，就含有硫酸铵的气味，如果这种制剂不经脱盐直接用于食品工业，不但影响食品的风味和工艺效果，而且工业硫酸铵中可能含有毒性物质，不符合卫生要求。
2)  有机溶剂沉淀法
①  有机溶剂的选择
    有机溶剂沉淀蛋白质的能力随蛋白质的种类及有机溶剂的种类而不同，对曲霉淀粉酶而言，有机溶剂的沉淀能力，丙酮>异丙醇>乙醇>甲醇。这个顺序还受温度、pH、盐离子浓度所影响，不是一成不变的。
②  有机溶剂的用量
    有机溶剂的沉淀能力受很多因素影响，特别是溶存盐类的影响尤为显著。当存在少量中性盐(0.1~0.2mol/L以上)时能产生盐溶作用。蛋白质在有机溶剂水溶液中的溶解度升高。多价阳离子如Ca2+，Zn2+与蛋白质结合，就能使蛋白质在水或有机溶剂中的溶解度降低，因而可以降低使酶沉淀的有机溶剂的浓度。
③工艺参数的影响
a  温度
    有机溶剂沉淀蛋白质的能力受温度的影响很大。一般言之，温度愈低沉淀愈完全。局部区域有机溶剂过浓，能够严重破坏蛋白质的空间结构造成酶的变性失活，在温度较高的条件下尤为显著。有机溶剂，特别是乙醇与水混合时放出大量热，使混合液的温度升高。因此在添加有机溶剂时，整个系统需要冷却，一般保持0 左右，同时强烈搅拌，以避免有机溶剂局部过热和液体局部过热。另外，已经沉淀的酶对有机溶剂变性的抵抗力大，所以过分延长添加溶剂的时间也是不利的。
b  pH值
    蛋白质在等电点的溶解度最低，但很多酶的等电点在pH4~5值之间，比其稳定的pH值范围低。在这种情况下必须采用目的酶稳定的pH值，然后是尽可能靠近其等电点。
    沉淀时酶液的温度和pH值不但对目的酶的收率具有决定性的影响，而且对酶的组成(各共存酶的比率)及单位重量沉淀物中目的酶的活力都有重要的关系。例如固体培养的米曲霉α-淀粉酶，用水抽出并过滤，清液预先冷却，在搅拌下加乙醇至终浓度70%，温度10 ，pH值5.6~6.0，α-淀粉酶的收率约94%。
2) 吸附法
①  白土及活性氧化铝吸附法
    白土类是以硅酸铝为主要成分的粘土，随其种类不同，能吸附酶或蛋白质的种类和数量也不同，一般在弱酸性条件下吸附酶或蛋白质，在中性或弱碱性条件下解吸。白土先用2mol/L盐酸活化。
    活性氧化铝也是最常用的吸附酶或蛋白质的吸附剂之一。可以用明矶、硫酸铵等调制，加热使之活性化。酶或蛋白质一般在弱酸性条件下吸附，在弱碱性条件下解吸。
②  淀粉吸附α-淀粉酶的方法
一定的酶只作用于特定的基质，这一事实说明两者之间有一种特别的亲和力。因此用基质吸附那种对基质具有特定作用的酶，可以达到很好的效果。但作为吸附剂的基质首先必须是固相物；其次在吸附酶的过程中，这种基质不会被它所吸附而又专门能作用于它的酶所分解，或分解程度极微；第三是单位重量的基质吸附这种特定酶的能力均应该足够大。现发现生淀粉对α-淀粉酶的吸附是比较接近于上述条件的。


酶制剂化和稳定化处理
浓缩的酶液可制成液体或固体酶制剂。酶制剂的出售是以一定体积或重量的酶活计价，所以生产出的酶制剂在出售前往往需要稀释至一定的标准酶活。同时为改进和提高酶制剂的储藏稳定性，一般都要在酶制剂中加入一种以上的物质，它们既可作酶活稳定剂，又可作抗菌剂及助滤剂，它们若制成干粉，则可起到填料、稀释剂和抗结块剂的作用。可用作酶活稳定剂的物质很多，如辅基、辅酶、金属离子、底物、整合剂、蛋白质等，最常用的有多元醇(如甘油、乙二醇、山梨醇、聚乙二醇等)、糖类、食盐、乙醇及有机钙。有时用一种稳定剂效果不明显，则需要几种物质合用，如明胶对细菌淀粉酶及蛋白酶有稳定作用，但效果不明显，若同时加人些乙醇和甘油，稳定效果就显著了