浅谈米曲霉3.042突变株高产酸性蛋白酶的发酵条件优化

酱油是以豆粕和麸皮为主要原料，利用曲霉等微生物发酵而成的一种调味品，富含蛋白质、多肽、氨基酸、糖分等。米曲霉(Aspergillusoryzae)作为酱油发酵的主要菌种，在酱油发酵过程中起到了决定作用，其酶系活性的高低将直接影响到原料的利用率和产品的产率，同时也影响酱油中可溶性含氮物的含量进而影响酱油的品质，因此对菌种的改良是酱油发酵行业永恒的工作。

目前我国大多数酱油生产厂家采用的米曲霉3.042，具有较高碱性和中性蛋白酶活力，酸性蛋白酶活力相对不足。为获得优良的菌株，国内对米曲霉3.042进行了反复的理化诱变和筛选，获得许多新型突变株，使得蛋白酶的活性得到了不同程度的提高。

常压室温等离子体(Atmospheric and RoomTemperature Plasma，ARTP)诱变系统是一种新型的诱变技术，能够在大气压下产生温度在25~40 之间、具有高浓度活性粒子的等离子体射流，使微生物细胞壁和细胞膜的结构及通透性发生改变，并引 起基因损伤，使得微生物基因序列和代谢网络发生变化，最终导致微生物产生突变。经诱变得到的突变株与出发菌株在形态方面会有变化，并与菌株生理性状以及生产能力方面有关，因此对菌株的形态研究在了解突变株性状方面有重要意义。

本研究以常压室温等离子体诱变米曲霉3.042得到的突变株B-2为对象，研究了B-2的微观形态、菌落形态以及酸性蛋白酶活力的变化，并优化了发酵培养条件，为突变株B-2在酱油生产中的应用提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、材料与试剂

米曲霉(A.oryzae)3.042(CGMCC No.3.00951)菌株：中国普通微生物菌株保藏管理中心；米曲霉突变株B-2(CGMCC No.8199)菌株：本实验室经ARTP诱变得到的高酸性蛋白酶活力菌株；豆粕、麸皮、黄豆粉：天津市天立独流老醋股份有限公司；酪蛋白、福林酚试剂：分析纯，北京索莱宝科技有限公司。

马铃薯葡萄糖培养基：称取200 g去皮马铃薯，切成小块，加入1000 mL蒸馏水煮沸30 min，用双层纱布过滤得到清液，再加入20 g葡萄糖，自然pH，固体培养基补加20 g琼脂，121 灭菌20min。

基础发酵培养基：豆粕20 g，麸皮15 g，加水20 mL，121 灭菌20 min。

1.2 主要仪器与设备

常压室温等离子体诱变系统(ARTP)：北京思清源生物科技有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；光学显微镜：OLYMPUS公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株形态观察 (1)孢子悬液制备：取37 培养3 d活化的PDA试管斜面，吸取10 mL无菌生理盐水加入试管中，震荡3 min，吸取菌悬液至10 mL灭菌离心管中，充分震荡2 min，即得孢子悬液。稀释至1106孢子/mL，常温保存备用。

(2)形态观察：微观形态采用载玻片培养观察法，菌落形态通过观察涂布孢子悬液的PDA培养基平板，并拍照记录。

1.3.2 酸性蛋白酶活力测定 称取发酵完成的成曲10 g，加200 mL 0.05 mol/L乳酸-乳酸钠缓冲液(pH3.0)于500 mL三角瓶中，37 、180 r/min摇床震荡1 h，4000 r/min室温离心10 min，上清用乳酸-乳酸钠缓冲液稀释10倍，即得粗酶液。采用福林酚法测定酸性蛋白酶活力，规定在40 下每分钟水解酪蛋白产生1 g酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位(U)。

2 结果与讨论

2.1 米曲霉3.042与突变株B-2比较

2.1.1 微观形态比较 图1表明，与米曲霉3.042相比，突变株B-2的菌丝与分生孢子的形态并没有显著的差异，米曲霉3.042的菌丝发达，但是分生孢子头较少，而突变株B-2的菌丝短，分生孢子头较多。但是在培养过程中发现，米曲霉3.042的菌丝较长，产孢子较慢，而突变株B-2的菌丝短，产孢子较快。

2.1.2 最佳发酵时间的确定 突变株B-2与出发菌株3.042的酸性蛋白酶活性随发酵时间的变化如图11所示，发酵18 h之后开始产酶。在48 h时，突变株B-2和出发菌株3.042的酸性蛋白酶活力均达到最大，但B-2的酶活比3.042高出51.3%。随着原料不断被米曲霉分解消耗，48 h之后，酶活力出现下降，因此确定这2个菌株的最适宜产酶时间均为48 h。

3 结论

突变株B-2与出发菌株3.042相比菌丝较短，分生孢子头多，产孢子较快。突变株B-2的菌落在酪蛋白平板(pH3.0)培养5 d呈现凸状隆起，而3.042则呈现类似脐突形的菌落；在固态发酵过程中B-2的生长速率明显优于3.042；突变株B-2的酸性蛋白酶活力比米曲霉3.042提高了39.9%。对突变株B-2的产酸性蛋白酶条件进行了单因素优化，得到的最佳培养条件为：麸皮70%，豆粕30%，加水量36%；发酵温度30 ，发酵时间48 h，接种量为1106孢子/35 g干曲。为今后推广突变株B-2在酱油发酵中的应用提供了基础。