雷帕霉素抑制大鼠移植肝胆管上皮细胞增殖作用的研究

毕业论文 作者：陈莉萍 戴睿武 郭毅斌 王曙光 董家鸿'

【关键词】 雷帕霉素； 肝移植； 冷保存； 再灌注； 胆管上皮细胞； 增殖

【Key words】 Rapamycin; Liver transplantation; Cold preservation; Reperfusion; Biliary epithelial cells; Proliferation

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

兔抗增殖细胞核抗原多克隆抗体、鼠抗p STAT3 tyr705单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；ChemMateTM Envision免疫组化试剂盒为丹麦Dako公司产品；RPM为美国惠氏百宫制药公司惠赠。

1.3 各组术后生存分析

1.4 肝功能指标检测

1.5 兔抗增殖细胞核抗原、α 平滑肌肌动蛋白免疫组织化学检测

肝组织常规固定、包埋、切片。采用兔抗增殖细胞核抗原作为细胞增殖期G1 S期的评价指标，α 平滑肌肌动蛋白作为肌纤维母细胞标志。按Chem MateTM Envision免疫组化试剂盒说明书操作。显微镜下观察α 平滑肌肌动蛋白表达阳性细胞的胞质呈棕色，增殖细胞的胞核呈棕色。计算7个高倍镜( 400)视野内，每100个胆管细胞中增殖的胆管上皮细胞所占比例的均值作为该样本的胆管上皮细胞增殖率［4］。

1.6 统计学分析

计量资料以 s表示，所有数据应用SPSS 10.0软件进行统计分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析，采用Kaplan Meier法绘制生存曲线，Log rank法检验各组生存率之间的差异。

2 结果

2.1 各组术后生存分析

冷保存12 h组生存率明显低于冷保存1 h组(P=0.017

4)，而与雷帕霉素组水平接近(P=0.89，图

1)。两组大鼠死亡的主要原因为移植肝肝功能不全，表现为肝脏淤血或伴有局灶性坏死，腹水、黄疸，肝功能酶谱升高，部分死亡大鼠胆管内可见褐色胆泥形成。

图1 各组肝移植术后生存曲线

2.2 各组肝功能检测

2.3 各组胆管上皮细胞增殖

2.4 胆管周围肌纤维母细胞分布

图2 肝移植术后胆管上皮细胞增殖(红色箭头所示为增殖细胞) (2氨基联苯胺染色 400)

图3 肝移植术后肌纤维母细胞分布(红色箭头所示为肌纤维母细胞) (2氨基联苯胺染色 400)

3 讨论

残存的胆管上皮细胞在对损伤做出再生修复时，虽然最终能恢复到近似原先的细胞形态，但在该过程中极有可能经历DNA损伤或基因序列改变，具有和正常细胞不同的功能，分泌多种与器官纤维化密切相关的细胞因子如TGF β等，促进胆管周围成纤维细胞活化转化为肌纤维母细胞，而后者的持续出现是器官纤维化过程的关键［6］。同时，大量而活跃的细胞分裂需要消耗较多的能量，就有可能削弱肝内非新生细胞正常的能量代谢过程［7］。这对移植物的长期存活及功能是不利的。我们观察到伴随着明显的胆管上皮细胞增殖，较多肌纤维母细胞环绕于冷保存12 h组胆管周围。这表明严重冷保存 再灌注诱导的胆管上皮细胞增殖可能是促进肌纤维母细胞聚集的重要因素。由于胆管上皮细胞和胆管周围肌纤维母细胞之间维持着非常精妙的平衡，冷保存 再灌注对胆管上皮细胞的严重损伤触发肌纤维母细胞的大量活化，导致胆管壁创面收缩，增加了胆管壁及其周围组织纤维化和胆管狭窄形成的风险，在肝外胆管或肝内大胆管常表现为管腔狭窄，在小胆管则可能出现管腔阻塞［8］。我们还观察到大胆管尤其肝门附近大胆管内壁的胆管上皮细胞增殖最为活跃，该区结缔组织丰富，内含大量成纤维细胞，极易受到胆管上皮细胞增殖的影响而活化为肌纤维母细胞。这也许正是临床观察到的肝门附近大胆管成为移植肝胆道狭窄易患部位的原因之1，也是影响移植物功能与存活的重要因素。

作为1种新型免疫抑制剂，体外和体内实验均证实雷帕霉素抑制胆管上皮细胞增殖，其有效抑制浓度远低于临床肝移植术后患者应用雷帕霉素作为免疫抑制剂时的血药浓度［9］。我们的研究也发现，雷帕霉素明显抑制由冷保存 再灌注损伤诱导的胆管上皮细胞增殖，并减少胆管周围肌纤维母细胞的聚集。雷帕霉素是信号转导及转录激活因子 3活化的特异性抑制剂，因而部分阻断转录激活因子 3介导的信号通路，从而调控细胞周期进展，影响细胞增殖与分化［10］，这可能是其抑制胆管上皮细胞增殖的分子机制之1。同时我们还观察到，雷帕霉素虽然明显抑制肝移植术后胆管上皮细胞的增殖，但并未降低术后14 d内生存率，进1步提示以胆管上皮细胞增殖为靶点的雷帕霉素极可能成为临床防治移植肝胆管周围纤维化、胆管狭窄等并发症的有力武器，将会更广泛地应用于肝移植领域。

【参考文献】

［2］ Ramadori G, Saile B. Portal tract fibrogenesis in the liver. Lab Invest,2004,84

(2):153-159.

［4］ Alvaro D, Alpini G, Onori P,

[1]